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线粒体dna G-四链体荧光配体的设计、合成及肿瘤诊疗研究

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线粒体DNA G-四链体荧光配体的设计、合成及肿瘤诊疗研究

作者：王亚坤广东工业大学

学位级别：硕士

近年来,由于细胞内G-四链体的形成与肿瘤发生发展、肿瘤凋亡等具有密切联系,被视为抗肿瘤药物开发的新靶点。对于研究线粒体dna G-四链体的形成对肿瘤治疗的效果、细胞内的调控机制,最有效的方法之一就是开发荧光配体,结合荧光显微成像... 详细信息

近年来,由于细胞内G-四链体的形成与肿瘤发生发展、肿瘤凋亡等具有密切联系,被视为抗肿瘤药物开发的新靶点。对于研究线粒体dna G-四链体的形成对肿瘤治疗的效果、细胞内的调控机制,最有效的方法之一就是开发荧光配体,结合荧光显微成像技术实现实时荧光示踪。但目前基于线粒体dna G-链体荧光配体的开发处于初步发展阶段,相关配体开发仍然不足,检测方法有限。基于此背景,本论文设计并合成了苯并噻唑-三苯胺衍生物SPN,并运用光谱学、生物化学等方法研究该化合物与线粒体dna G-四链体的相互作用和生物活性。本论文的研究内容主要包括:（1）经高斯模拟计算、分子设计与化学合成目标化合物,并对目标化合物苯并噻唑-三苯胺衍生物进行结构表征;（2）运用荧光光谱、肉眼观察探究化合物SPN对线粒体dna G-四链体的结合选择性、灵敏性、荧光性能、荧光稳定性及两者之间的结合性能;（3）运用CD光谱、CD熔点、紫外滴定、荧光滴定及Job plot分析化合物SPN与线粒体dna G-四链体之间的结合模式及相互作用机制;（4）通过细胞毒性、细胞成像、线粒体分离的荧光分析、亚细胞共定位成像探究化合物对线粒体的靶向能力及靶向机制;（5）通过酶解实验、细胞内竞争实验确定SPN在细胞内的荧光响应结合位点;（6）通过细胞成像探究化合物SPN作为肿瘤诊断探针的应用潜力。结果表明化合物SPN对线粒体dna G-四链体具有优异的选择性和亲和力,并具有稳定线粒体dna G-四链体构象的能力;在溶液体系和细胞体系中,化合物SPN都表现出可以同线粒体dna G-四链体结合并发出荧光,且主要分布于细胞质线粒体内;该化合物SPN在肿瘤成像中的结果表明本课题成功开发了一种高选择性、高灵敏度、高稳定性的线粒体dna G-四链体荧光配体SPN,为线粒体dna G-四链体及机制探究提供了一种有利工具,其对肿瘤的成像效果进一步验证线粒体dna G-四链体为肿瘤诊断的理想靶点。已经有大量的研究在肿瘤细胞中采用不同的线粒体靶向策略进行肿瘤光疗,但仍存在一定的局限性。同时,单纯依赖于稳定dna G-四链体来干扰基因组的稳定性,对于肿瘤的治疗效果往往有限。基于以上研究背景,本论文提出以线粒体作为光动力治疗靶点,通过氧化损伤裸露的线粒体dna,来实现协同加强线粒体dna G-四链体稳定的肿瘤治疗,可能改善单独PDT和单独稳定G-四链体的抗肿瘤活性不佳的问题。具体内容为:（1）通过紫外光谱分析化合物的ROS生成效率;（2）通过CCK-8实验、群体倍增实验、细胞划痕实验探究化合物SPN稳定线粒体dna G-四链体后,对肿瘤增殖、基因组稳定性以及肿瘤迁移能力进行初步探究;（3）进一步探究了化合物SPN在细胞内产生ROS的能力及其光分解产物的细胞毒性;（4）最后通过CCK-8法和细胞活死染色探究了PDT激活后,协同线粒体dna G-四链体稳定的抗肿瘤活性。在肿瘤治疗中,该衍生物SPN溶液体系和细胞体系中均表现出高效的ROS生成效率;化合物SPN在CD熔点实验中表现出具有稳定线粒体dna G-四链体的能力,在细胞内具有选择性抗肿瘤活性,这可能归因于该化合物稳定肿瘤细胞线粒体dna G-四链体后,通过影响线粒体dna的复制、转录和表达,从而诱导的细胞凋亡;最后细胞毒性及活死染色实验证明,结合PDT后,化合物SPN对肿瘤的消融更加高效、彻底。这种多功效协同的单分子化合物,以线粒体dna为靶点,通过PDT协同加强线粒体G-四链体dna稳定后的抗肿瘤活性。

关键词：线粒体dna G-四链体荧光配体肿瘤诊疗协同治疗

线粒体dna遗传变异与系统性红斑狼疮易感性、糖皮质激素疗效及预后的关联性研究

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线粒体DNA遗传变异与系统性红斑狼疮易感性、糖皮质激素疗效及预...

作者：滕影安徽医科大学

学位级别：硕士

目的探讨线粒体dna(Mitochondrial dna,mt dna)遗传变异与系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)易感性、糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)治疗疗效及SLE患者预后之间是否存在关联。方法采用两阶段研究方法。初筛阶段,选取... 详细信息

目的探讨线粒体dna(Mitochondrial dna,mt dna)遗传变异与系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)易感性、糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)治疗疗效及SLE患者预后之间是否存在关联。方法采用两阶段研究方法。初筛阶段,选取100例SLE患者和100例正常对照,采用二代测序法进行线粒体全基因组测序,筛选出与疾病易感性相关的潜在mt dna遗传变异。验证阶段,在另外一组样本(505例SLE患者和504例正常对照)中验证初筛发现的mt dna遗传变异。在两阶段病例对照研究中,共纳入605例SLE患者和604例正常对照。为研究mt dna遗传变异与SLE患者GCs疗效之间的关系,初筛阶段对100例SLE患者(50例GCs敏感和50例GCs不敏感)进行线粒体全基因组测序,筛选出可能与GCs疗效相关的mt dna遗传变异。随后,431例SLE患者入选进验证阶段,对他们进行为期12周的随访以评估GCs疗效,其中412例患者完成了随访,共512例SLE患者完成两阶段疗效研究。定期随访患者以探讨mt dna遗传变异与SLE预后之间是否存在关联。我们以疾病复发作为预后指标,复发定义为对患者两次随访之间SLE疾病活动指数(SLE Disease Activity Index,SLEDAI)增加大于等于4分。采用叉生法、Logistic回归模型来分析相加与相乘交互作用,运用多因子降维法(Multifactor-Dimensionality Reduction,MDR)分析mt dna遗传变异与环境因素之间的多因素交互作用。结果初筛阶段,共筛选出9个mt dna遗传变异(C151T,A4833G,T5108C,A8701G,A12358G,G12372A,G14569A,T15940del,CA514-515del)可能与SLE易感性相关,4个mt dna遗传变异(T16362C,T16519C,302Ins C,302Ins CC)可能与SLE患者GCs治疗疗效有关。验证阶段,共验证出4个mt dna遗传变异(A4833G,T5108C,G14569A,CA514-515del)与SLE易感性存在关联。在合并两阶段研究的样本中,这些遗传变异与SLE的相关性依然存在(A4833G:OR=4.461,95%CI=2.136-9.315,P=6.863×10,P=2.745×10;T5108C:OR=4.155,95%CI=2.120-8.143,P=3.346×10,P=2.677×10;G14569A:OR=2.192,95%CI=1.286-3.736,P=0.004,P=0.011;CA514-515del:OR=0.744,95%CI=0.593-0.933,P=0.010,P=0.020)。合并初筛和验证分析后,结果发现mt dna遗传变异T16362C与SLE患者GCs疗效之间存在关联,携带这一变异的个体对GCs治疗效果好(OR=0.587,95%CI=0.384-0.898,P=0.014,P=0.014)。性别分层分析发现mt dna遗传变异T16362C(OR=0.537,95%CI=0.341-0.847,P=0.007,P=0.011)和T16519C(OR=1.778,95%CI=1.197-2.643,P=0.004,P=0.011)与女性SLE患者GCs疗效相关。在预后随访研究中,我们发现mt dna遗传变异A4833G(校正HR=12.110,95%CI=2.676-54.795,P=0.001,P=0.003)和G14569A(校正HR=8.087,95%CI=2.729-23.964,P=1.624×10,P=9.744×10)显著增加了SLE患者复发风险。按性别分层后,携带T5108C(校正HR=8.230,95%CI=1.886-35.920,P=0.005,P=0.010)和T16362C(校正HR=1.778,95%CI=1.126-2.807,P=0.014,P=0.021)遗传变异的女性SLE患者更容易复发。单倍型分析显示,mt dna单倍型G与SLE易感性(校正OR=4.336,95%CI=2.073-9.072,P=9.791×10,P=0.001)和SLE患者预后(校正HR=12.109,95%CI=2.676-54.787,P=0.001,P=0.013)之间存在关联。此外,我们还观察到mt dna遗传变异与环境因素之间存在交互作用。结论本研究发现了与SLE易感性、GCs治疗疗效及SLE预后相关的新的mt dna遗传变异,mt dna遗传变异与环境因素的交互作用与SLE易感性和GCs疗效相关。我们的研究结果为今后从mt dna遗传角度了解SLE发生发展提供重要信息。

关键词：系统性红斑狼疮线粒体dna 遗传变异糖皮质激素预后

鳙长江中下游群体的D-loop序列遗传分析

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上海海洋大学学报 2024年第3期33卷 521-532页

作者：傅建军朱文彬罗明坤王兰梅董在杰中国水产科学研究院淡水渔业研究中心、农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室江苏无锡214081

为了探究长江中下游鳙的种质遗传现状,该研究收集了石首(SS)、长沙(CS)、瑞昌(RC)、扬州(YZ)和张家港(ZJG)的长江种群(YR,219尾),对其D-loop序列进行检测分析,并结合NCBI下载整理的珠江种群(PR,213尾)和北美种群(NA,33尾)开展比较研究... 详细信息

为了探究长江中下游鳙的种质遗传现状,该研究收集了石首(SS)、长沙(CS)、瑞昌(RC)、扬州(YZ)和张家港(ZJG)的长江种群(YR,219尾),对其D-loop序列进行检测分析,并结合NCBI下载整理的珠江种群(PR,213尾)和北美种群(NA,33尾)开展比较研究。结果显示,在YR、PR和NA的D-loop序列中分别检测到35、96和11个变异位点,并分别界定37、62和3个单倍型。在长江中下游的5个鳙群体中,单倍型多样性(H_(d))为0.798~0.897,核苷酸多样性(π)为0.00338~0.00653。长江中下游5个鳙群体间,RC与ZJG(F_(ST)=0.012)和CS与YZ(F_(ST)=0.018)的遗传分化不显著,其余群体间均存在显著遗传分化(F_(ST)为0.031~0.125);群体间检测到不同程度的基因流(N_(m)为3.509~39.993)。基于单倍型网络分析,长江中下游的鳙D-loop序列单倍型存在多个分支,并在群体间存在明显的共享;YR和PR的中心单倍型存在广泛共享,PR的特有单倍型均为外围单倍型,并推测NA的形成存在不同的遗传来源。基于中性检验结果,推测PR在历史上经历过种群扩张。研究表明,长江和珠江的鳙种群维持了较高的遗传多样性,可为其种质资源保护和利用奠定物质基础。

关键词：鳙线粒体dna D-loop序列种群多样性遗传分化

贵州省东方蜜蜂Apis cerana线粒体dna遗传多样性研究

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环境昆虫学报 2022年第3期44卷 595-605页

作者：赵金玉龙见坤 DAVID Tembong Cham 陈祥盛常志敏贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学昆虫研究所贵阳550025 贵州大学昆虫资源开发利用省级特色重点实验室贵阳550025

为探明贵州省东方蜜蜂Apis cerana遗传多样性及遗传分化现状,对贵州省9个地级市79个样点采集的东方蜜蜂样本线粒体dna(mt dna)COI-COII序列进行扩增与测序,分析其遗传多样性、遗传结构及亲缘关系。序列结果显示扩增后COI-COII序列长度约... 详细信息

为探明贵州省东方蜜蜂Apis cerana遗传多样性及遗传分化现状,对贵州省9个地级市79个样点采集的东方蜜蜂样本线粒体dna(mt dna)COI-COII序列进行扩增与测序,分析其遗传多样性、遗传结构及亲缘关系。序列结果显示扩增后COI-COII序列长度约为760 bp,A+T平均含量(82.3%)明显高于C+G(17.7%),碱基偏移性明显。单倍型分析共发现33个单倍型,其中主体单倍型H1为9个地理群体共有。单倍型多样度分析表明平均单倍型多样度为0.802,其中黔南地区最高,遵义地区最低;平均核苷酸多样度为0.014,其中六盘水地区最高,黔西南及安顺地区最低。中性检验结果表明贵州省部分地区东方蜜蜂可能经历过群体扩张。9个地区样点的平均遗传距离介于0.0012~0.0044之间,其中毕节与黔东南地区间最大,为0.0044,安顺与黔南、遵义地区间最小,均为0.0012。在单倍型系统进化树中,79个样点东方蜜蜂可分为两个类群。研究结果为贵州省东方蜜蜂遗传分化研究、种质资源保护与开发利用提供参考依据。

关键词：贵州省东方蜜蜂线粒体dna 遗传多样性遗传距离

基于线粒体dna tRNA^(leu)-COⅡ序列的浙江省东方蜜蜂遗传多样性研究

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浙江农业学报 2022年第11期34卷 2395-2403页

作者：曹联飞施金虎徐雅岚苏晓玲胡福良郑火青浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021 浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站浙江杭州310021 浙江大学动物科学学院浙江杭州310058 金华市农业科学研究院浙江金华321000

为进一步了解浙江省东方蜜蜂的遗传多样性状况,基于浙江省10个地级市的448群东方蜜蜂样本,利用线粒体dna tRNA^(leu)-COⅡ序列进行遗传变异与群体遗传结构分析。结果显示,共获得46个单倍型,单倍型多样度为0.6657,核苷酸多样度为0.00261... 详细信息

为进一步了解浙江省东方蜜蜂的遗传多样性状况,基于浙江省10个地级市的448群东方蜜蜂样本,利用线粒体dna tRNA^(leu)-COⅡ序列进行遗传变异与群体遗传结构分析。结果显示,共获得46个单倍型,单倍型多样度为0.6657,核苷酸多样度为0.00261,表明浙江省东方蜜蜂具有较高的单倍型多样度、较低的核苷酸多样度。中性检验和单倍型网络图分析显示,浙江省东方蜜蜂可能经历了群体扩张事件。群体遗传结构分析显示,杭州、宁波与周边其他地区存在一定程度的遗传分化,可能与东方蜜蜂在当地的长期生存适应,以及一定的地理隔离有关。研究还新发现一个与国内其他地区东方蜜蜂差异较大的特殊单倍型。

关键词：浙江东方蜜蜂遗传多样性线粒体dna

线粒体dna 3243A→G异质水平定量检测方法的建立及应用

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中华医学遗传学杂志 2014年第4期31卷 438-443页

作者：张小勤陈琳杨宇郑超颜景斌路兆宁吕建新李伟浙江省温州医科大学检验医学院、生命科学学院 325035 浙江省温州医科大学检验医学院附属第二医院内分泌科上海交通大学医学遗传研究所

目的针对线粒体糖尿病致病位点mtdna 3243A→G异质性突变，建立一种快速简便、低成本，但相对准确、敏感的定量检测方法，为不同条件下选择最佳检测方案提供参考。方法收集浙江省温州市一个母系遗传性线粒体糖尿病伴耳聋家系（maternall... 详细信息

目的针对线粒体糖尿病致病位点mtdna 3243A→G异质性突变，建立一种快速简便、低成本，但相对准确、敏感的定量检测方法，为不同条件下选择最佳检测方案提供参考。方法收集浙江省温州市一个母系遗传性线粒体糖尿病伴耳聋家系（maternally inherited diabetes and deafness MIDD）共17人，提取外周血全基因组dna，同时分别应用PCR-限制性片段长度多态性技术（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism PCR-RLFP）、实时荧光定量PCR结合突变阻滞形成系统（realtime-amplification refractory mutation system-quantitative PCR，RT-ARMS-qPCR）和焦磷酸测序技术检测mtdna A3243G突变的异质水平；并以0～100％不同比例A3243G突变负荷的11个标准品为对照，3种方法同时分别检测，根据实际检测值与预期检测值的相关程度，对这三种检测方法做出可靠性比较分析。结果PCR-RFLP、RTARMS-qPCR和焦磷酸测序技术对A3243G定量标准品的检测结果中，PCR-RFLP相对定量分析结果与预期值之间呈直线相关，决定系数R2=0．828；RT-ARMS-qPCR检测11个标准对照的突变负荷结果与预期值之间呈直线相关，决定系数R2=0．998；焦磷酸测序技术检测结果与预期值之间呈直线相关，决定系数R2=0．997。定量检测A3243G异质水平结果PCR-RFLP介于10％～60％，RTARMS-qPCR为0到100％，焦磷酸测序技术为1％到95％；RTARMS-qPCR和焦磷酸测序技术的检测结果均接近预期值；针对MIDD家系17位成员的检测中A3243G突变携带者有13例，非A3243G突变携带者有4份，这三种方法定性检测结果一致。RT-ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术两种方法定量检测结果差异无统计学意义（t=1．140，P〉0．05）。结论针对mtdna 3243A→G异质性突变的定量检测方法，PCR-RFLP不适合定量检测，但可作为一种临床检测方法用于人群初步筛查。对于低异质水平的A3243G突变可用RT ARMS-qPCR和焦磷酸测序技术两种方法检测，但RT ARMS-qPCR相对于焦磷酸测序技术更简便、快速、可靠，成本低，是普通实验室和临床检测低异质负荷的最佳选择方案。

关键词：线粒体dna PCR-限制性片段长度多态性技术实时荧光定量PCR结合突变阻滞形成系统焦磷酸测序技术

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魁蚶3个群体及杂交子代遗传多样性分析

水产科学 2024年第4期43卷 561-570页

作者：刘童王英俊吴莹莹邹琰吕芳吴海一李建民宋爱环山东省海洋科学研究院山东青岛266104 青岛市近海生态修复与安全保障重点实验室山东青岛266104 山东省智慧海洋牧场重点实验室(筹) 山东青岛266104 青岛市海洋生物种质资源挖掘与利用工程实验室山东青岛266104 日照山海天旅游度假区渔政监督管理站山东日照276800

为探明魁蚶不同群体间遗传多样性差异,以魁蚶中国群体、韩国群体和杂交子一代群体为研究对象,利用线粒体基因(16S rRNA和COⅠ)和核糖体内部转录间隔区(ITS-1)对5个魁蚶群体共150个样本进行遗传多样性分析。结果显示,魁蚶16S rRNA、COⅠ... 详细信息

为探明魁蚶不同群体间遗传多样性差异,以魁蚶中国群体、韩国群体和杂交子一代群体为研究对象,利用线粒体基因(16S rRNA和COⅠ)和核糖体内部转录间隔区(ITS-1)对5个魁蚶群体共150个样本进行遗传多样性分析。结果显示,魁蚶16S rRNA、COⅠ和ITS-1同源序列片段长度分别为605、766 bp和419 bp,其中16S rRNA和COⅠ基因片段A+T含量均高于G+C含量,ITS-1片段A+T含量均低于G+C含量。16S rRNA和COⅠ基因分别定义了4个和14个单倍型,主体单倍型所占频率分别为81.58%和61.43%,ITS-1定义了24种单倍型,主体单倍型所占频率为50.67%。单倍型邻接关系树结果显示,16S rRNA和COⅠ基因均为4个子一代群体聚为1支,即墨群体独有的单倍型为1支,而ITS-1的分支无明显群体特征。16S rRNA和COⅠ的遗传分化结果均表明,即墨群体与其他4个群体间遗传分化较大,其他4个群体间不存在分化;ITS-1的结果显示,5个群体间的遗传分化指数值均小于0.25,遗传分化不明显。试验结果表明,在进行魁蚶种内遗传进化研究时,线粒体基因的敏感性高于核糖体基因,即墨群体的遗传多样性明显高于4个子一代群体。

关键词：水生生物学遗传多样性线粒体dna 核糖体dna 魁蚶

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线粒体dna突变与相关人类疾病

遗传 2007年第11期29卷 1299-1308页

作者：陈刚杜卫东曹慧敏安徽医科大学省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室安徽省基因研究重点实验室中国科学院上海微系统与信息技术研究所上海200050

在过去的20年里,人们发现线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)突变与多种人类疾病相关,其致病范围从单器官组织损害到多系统受累。文章目的在于探讨mtdna突变与人类疾病的关系。文章重点论述:(1)线粒体遗传学特征;(2)mtdna突变与人类遗... 详细信息

在过去的20年里,人们发现线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)突变与多种人类疾病相关,其致病范围从单器官组织损害到多系统受累。文章目的在于探讨mtdna突变与人类疾病的关系。文章重点论述:(1)线粒体遗传学特征;(2)mtdna突变与人类遗传性疾病;(3)体细胞mtdna突变在衰老和肿瘤中的作用;(4)mtdna疾病的诊断和治疗。

关键词：线粒体疾病线粒体dna 突变诊断

中国汉族人群线粒体dna单倍群与尿酸水平的关联研究

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复旦学报（自然科学版） 2023年第3期62卷 392-399页

作者：陈璐谭婧泽王久存金力郑鸿翔复旦大学生命科学学院人类遗传学与人类学系现代人类学教育部重点实验室上海200438

尿酸(UA)是人体内嘌呤核苷酸代谢的最终产物,与多种慢性疾病相关。因线粒体处于人体代谢的核心位置,线粒体dna变异可能影响血液中尿酸水平。本研究对来自广西南宁、江苏泰州和河南郑州的3个中国汉族人群共计2837例样本(其中男性样本111... 详细信息

尿酸(UA)是人体内嘌呤核苷酸代谢的最终产物,与多种慢性疾病相关。因线粒体处于人体代谢的核心位置,线粒体dna变异可能影响血液中尿酸水平。本研究对来自广西南宁、江苏泰州和河南郑州的3个中国汉族人群共计2837例样本(其中男性样本1112例、女性样本1725例)进行分析,对样本初始的UA值矫正了性别和年龄因素。本研究根据线粒体dna的变异将受试者分为16种基础单倍群,通过比较每个单倍群样本和其他样本的UA水平差异,探索线粒体单倍群和UA的相关性。在总体3个汉族人群中,M8单倍群的UA矫正值((310.5±87.2)μmol/L)显著低于其他单倍群((326.1±80.6)μmol/L,P=0.02),B5单倍群的UA矫正值((338.8±72.5)μmol/L)显著高于其他单倍群((324.9±81.2)μmol/L,P=0.01)。本研究结合后续分析发现,在总人群、南宁人群和泰州人群女性数据中,M8单倍群均与低UA水平显著相关;在总人群和女性数据中,B5单倍群与高UA水平显著相关。综上所述,本研究在中国汉族人群中发现了与UA水平显著相关的线粒体单倍群,为后续线粒体dna变异在尿酸代谢中的作用机制研究提供线索。

关键词：中国汉族人群尿酸线粒体dna 关联研究