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中国人兽共患病杂志 2005年第10期21卷 863-866页

作者：徐劲郑南才吴忠道陈守义胡旭初应康余新炳中山大学基础医学院病原生物学教研室复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室

目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目... 详细信息

目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂。结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6U/mg。1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5’-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49。结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子。

关键词：华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶异源表达酶动力学参数抑制

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耐药性癫患者脑组织线粒体mMDHNDUFC_2基因表达异常

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中国神经精神疾病杂志 2006年第1期32卷 27-31页

作者：刘凤英王学峰龚云李劲梅孙纪军席志芹吴原晏勇奕国明王玉平李云林张建国重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室重庆400016 首都医科大学天坛医院北京市神经外科研究所首都医科大学宣武医院

目的研究耐药性癫患者脑细胞线粒体mMDH、NDUFC2表达,探讨其在耐药性癫癎形成中的作用。方法分别提取48例耐药性癫癎患者、8例非耐药性癫患者及8例对照组脑组织标本的总RNA后,用基因芯片对其进行扫描,随后用荧光定量PCR技术进行验... 详细信息

目的研究耐药性癫患者脑细胞线粒体mMDH、NDUFC2表达,探讨其在耐药性癫癎形成中的作用。方法分别提取48例耐药性癫癎患者、8例非耐药性癫患者及8例对照组脑组织标本的总RNA后,用基因芯片对其进行扫描,随后用荧光定量PCR技术进行验证。结果发现与线粒体功能有关的基因mMDH、NDUFC2在耐药性癫癎中显著下调,荧光定量RT—PCR验证结果与基因芯片一致。结论脑细胞线粒体基因mMDH、NDUFC2表达异常可能通过能量代谢及神经元坏死参与了耐药性癫癎的形成。

关键词：耐药性癫痫线粒体苹果酸脱氢酶基因芯片荧光定量RT-PCR

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低磷胁迫下草酸青霉菌BK溶磷的分子机制

低磷胁迫下草酸青霉菌BK溶磷的分子机制

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作者：张健大连理工大学

学位级别：硕士

磷是限制植物生长的主要营养元素之一。土壤磷素丰富,但大部分以难溶性磷形式存在,供植物利用的有效性很低,利用微生物活化土壤难溶态磷是长期以来的研究热点。目前普遍认为,分泌有机酸是微生物溶解难溶性无机磷源的主要机理,但广泛的... 详细信息

磷是限制植物生长的主要营养元素之一。土壤磷素丰富,但大部分以难溶性磷形式存在,供植物利用的有效性很低,利用微生物活化土壤难溶态磷是长期以来的研究热点。目前普遍认为,分泌有机酸是微生物溶解难溶性无机磷源的主要机理,但广泛的研究结果(尤其是对于溶磷真菌)大都集中在有机酸代谢产物分析,研究手段也仅限于生物化学和定性定量检测。关于溶磷过程的分子表达调控机制至今未取得明确进展,这极大的影响了溶磷微生物作为生物磷肥在农业生态系统中的应用。本研究从筛选高效溶磷真菌出发,定性定量分析了菌体溶磷过程中有机酸代谢机制;研究了有机酸代谢网络通路中溶磷功能相关的两个关键基因对低磷胁迫的表达响应模式,初步阐明真菌响应磷胁迫压力的分子作用机理。取得的主要成果如下：以难溶性磷酸钙为唯一无机磷源,从番茄根际土壤中筛选出一株高效溶磷真菌BK,初步溶磷能力为685mg/L。通过对BK菌体DNA进行ITS序列分析,确定菌株BK属于草酸青霉菌属(Penicillium oxalicum)。通过优化碳源和氮源底物培养条件,极大提高了BK的溶磷能力,最大溶磷能力为853mg/L。在Ca3(PO4)2为唯一磷源、底物优化后的培养条件下,明确了BK的溶磷能力随pH下降逐渐增强,第5天时溶磷能力达到最大值,培养基pH值降低至2.5,初步推断有机酸的产生参与了草酸青霉菌BK溶磷的主要机制。建立了高效液相色谱(HPLC)分离BK菌溶磷代谢产物最佳条件：流动相为1%甲醇-0.02mol/L KH2PO4(pH2.6)缓冲液,流速为0.5ml/min,进样量10μl,检测波长210nm,柱温25℃。利用该条件对低磷胁迫和非磷胁迫下菌体发酵液中有机酸的动态变化进行了定性定量分析。色谱结果表明,磷胁迫使得草酸青霉菌BK产生约4倍于可溶磷条件的苹果酸,并极大减少了草酸的分泌,进一步说明了苹果酸代谢积累在草酸青霉菌BK溶磷过程中发挥着主要作用。研究了两个溶磷相关的关键功能基因线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)和富马酸酶(Fumarase)基因在低磷胁迫和非磷胁迫条件下表达响应模式。实时荧光定量PCR检测结果表明,mMDH基因的转录水平从第3天开始升高,最高可达到非磷胁迫条件下的8.7倍。Fumarase基因从第5天开始表现出过量表达,为非磷胁迫下的1.9倍。同时这两个基因编码的蛋白酶活性与基因转录水平变化趋势基本一致。因此,本论文首次在分子水平上阐明了磷胁迫压力下,草酸青霉菌BK可通过提高编码苹果酸合成反应的催化酶基因表达,增加苹果酸的分泌和积累,从而响应环境磷胁迫压力。

关键词：草酸青霉低磷胁迫有机酸线粒体苹果酸脱氢酶富马酸酶分子机制

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