检索结果-南通市图书馆

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

产热脂肪细胞中线粒体代谢适应的调节

中国生物化学与分子生物学报 2024年第7期 897-906页

作者：崔轩施亭潘东宁上海交通大学医学院附属第一人民医院临床研究院复旦大学基础医学院代谢分子医学教育部重点实验室

伴随经济的快速发展和人类生活水平的提高，肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等各种代谢功能紊乱疾病已成为我国重要的公共卫生问题。产热脂肪细胞含有丰富的线粒体以及解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1),可通过消耗甘油三酯和葡... 详细信息

伴随经济的快速发展和人类生活水平的提高，肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等各种代谢功能紊乱疾病已成为我国重要的公共卫生问题。产热脂肪细胞含有丰富的线粒体以及解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1),可通过消耗甘油三酯和葡萄糖并以非颤抖性产热的方式来维持哺乳动物核心体温，鉴于产热过程增加体内能量消耗，因此，激活产热脂肪成为防治糖脂代谢紊乱性疾病的重要研究方向。线粒体作为产热脂肪细胞中功能高度保守的细胞器，在产热激活和失活过程中出现代谢适应性的改变以响应产热能力的变化，而产热脂肪细胞中线粒体代谢适应的失调则可能造成产热能力损伤，甚至全身代谢紊乱。本文概述了近年来报道的产热脂肪细胞线粒体多方面的灵活重塑，包括线粒体动力学变化、磷脂和嵴的重塑以及线粒体活性氧水平和氧化应激等方面，全面地总结了相关的调控因子，最后对脂肪细胞产热能力的维持提供了深入的见解，展望了未来有关产热脂肪细胞线粒体的研究方向，以期为开发靶向新药以激活脂肪产热来对抗代谢性疾病提供理论参考。

关键词：产热脂肪组织线粒体动力学蛋白质质量控制嵴线粒体应激

雌激素拮抗ASIC1a诱导的软骨细胞线粒体应激在类风湿关节炎中的作用及机制研究

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

雌激素拮抗ASIC1a诱导的软骨细胞线粒体应激在类风湿关节炎中的作...

作者：宰卓妍安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因未明的慢性,全身性,自身免疫性疾病,其发病率与性别差异有关。女性在绝经后达到RA发病率的高峰,而排卵后可以暂时缓解RA疾病症状,提示雌激素水平的变化可能在RA的发生发展中起关键作用... 详细信息

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因未明的慢性,全身性,自身免疫性疾病,其发病率与性别差异有关。女性在绝经后达到RA发病率的高峰,而排卵后可以暂时缓解RA疾病症状,提示雌激素水平的变化可能在RA的发生发展中起关键作用。前期研究表明,软骨细胞死亡导致的关节软骨和骨骼的破坏是引起RA关节功能障碍的主要原因,并且组织酸化是导致软骨细胞死亡的重要因素。酸敏感离子通道1a(Acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)是一种响应于细胞外酸化信号,进而介导钙离子内流,最终导致软骨细胞和组织损伤的重要离子通道。课题组前期研究成果表明雌激素通过自噬溶酶体途径诱导ASIC1a蛋白降解,保护软骨细胞免受酸中毒的影响,进而起到保护关节软骨的作用。在病理条件下,钙离子超载可引起线粒体应激介导细胞死亡和组织损伤,但钙离子在RA中的潜在功能尚不清楚。目的:本研究主要阐明ASIC1a引起的软骨损伤过程中是否会发生线粒体应激,以及雌激素是否可以通过调控ASIC1a功能来拮抗线粒体应激,旨在为RA的发病机制和治疗策略提供新见解。方法:1.ASIC1a激活对线粒体应激的影响采用p H 6.0酸溶液分别刺激软骨细胞不同时间(0 h,45 min,1.5 h,3 h,6h,12 h),实时定量PCR(Real-time quantification-polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测酸刺激激活ASIC1a对线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P m RNA水平的影响,免疫荧光法检测ASIC1a激活对线粒体应激蛋白HSP10和LONP1的荧光水平影响。应用JC-1试剂盒检测ASIC1a激活对线粒体膜电位的影响,靶向线粒体活性氧(Mitochondrial Reactive oxygen species,mt ROS)荧光探针检测线粒体ROS水平变化。最后用透射电镜观察酸刺激对线粒体形态的影响。采用ASIC1a特异性抑制剂狼蛛毒素(Psalmotoxin-1,Pc Tx-1)预处理细胞后加酸刺激6 h。免疫荧光检测抑制ASIC1a活性后线粒体应激蛋白表达情况,激光共聚焦检测线粒体膜电位和mt ROS,透射电镜观察线粒体形态。2.ASIC1a激活介导的钙离子内流对线粒体应激的影响用p H 6.0酸溶液分别刺激软骨细胞不同时间(0 h,45 min,1.5 h,3 h,6 h,12 h),用Fura-3/AM探针检测Ca水平。用钙离子螯合剂乙二醇四乙酸(Ethylene Glycol Tetraacetic Acid,EGTA)处理软骨细胞,RT-q PCR和免疫荧光分别检测阻断细胞外Ca内流后胞内线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P的m RNA和荧光水平变化,激光共聚焦检测线粒体膜电位和mt ROS释放量变化。3.雌激素对ASIC1a功能的影响Western blot检测雌激素在不同时间下(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72 h)对ASIC1a蛋白表达的影响。接下来将细胞分为对照组,p H 6.0组,雌激素+p H6.0组,Pc Tx-1+p H 6.0组,用免疫荧光检测ASIC1a荧光水平,Fura-3/AM探针标记细胞内Ca后观察Ca水平变化。4.雌激素对ASIC1a介导的线粒体应激的影响分别使用雌激素和Pc Tx-1处理大鼠关节软骨细胞,RT-q PCR检测线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P m RNA水平。用雌激素预处理细胞48 h后用p H 6.0酸刺激6 h,免疫荧光检测线粒体应激蛋白HSP10,LONP1,Clp P荧光水平,激光共聚焦检测mt ROS和线粒体膜电位水平,透射电子显微镜观察雌激素对线粒体形态改变的作用。5.雌激素对AA大鼠关节软骨的保护作用将雌性SD大鼠进行卵巢摘除手术后分为以下几组:正常组,AA模型组,雌激素给药组(低剂量:0.1 mg/kg;中剂量:0.2 mg/kg;高剂量:0.3 mg/kg),阳性药曲安奈德组(Triamcinolone acetonide,TA)组。另外假手术组只对卵巢周围脂肪组织进行摘除。采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)法观察大鼠关节组织病理学病变,甲苯胺蓝对关节进行染色,用玻片扫描仪观察大鼠软骨损伤情况。免疫组织化学法检测线粒体应激蛋白(HSP10,LONP1,Clp P)表达情况。结果:1.ASIC1a激活对线粒体应激的影响与正常大鼠关节软骨细胞相比,酸刺激导致线粒体应激蛋白m RNA和荧光水平上升,线粒体膜电位下降,mt ROS释放量增加,此外线粒体逐渐出现肿胀、嵴断裂破坏、膜破坏等一些结构损伤。抑制ASIC1a活性可以明显降低线粒体应激蛋白由于酸刺激导致的表达升高现象,并翻转酸刺激导致的线粒体膜电位下降现象,使mt

关键词：类风湿关节炎线粒体应激雌激素 ASIC1a 钙离子

Genipin通过线粒体应激和内质网应激调控线粒体自噬减轻HT22细胞氧糖剥夺损伤

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Genipin通过线粒体应激和内质网应激调控线粒体自噬减轻HT22细胞...

作者：金雪吉林大学

学位级别：硕士

背景:脑缺血是由流向大脑的血流扰动引起的,这些扰动会触发连续和复杂的代谢和细胞病变,对于急性缺血性卒中(Acute Ischemia Stroke,AIS)患者给予静脉溶栓并结合机械取栓,这样的治疗手段会引起脑缺血再灌注损伤,分析其潜在的生物学机制... 详细信息

背景:脑缺血是由流向大脑的血流扰动引起的,这些扰动会触发连续和复杂的代谢和细胞病变,对于急性缺血性卒中(Acute Ischemia Stroke,AIS)患者给予静脉溶栓并结合机械取栓,这样的治疗手段会引起脑缺血再灌注损伤,分析其潜在的生物学机制,为神经元死亡的治疗提供新的切入点。由于海马神经元对缺糖缺氧较为敏感,即使是短期缺乏葡萄糖和氧气也会对神经元细胞造成极大的损害,在某些情况下甚至会导致细胞死亡。实验室对小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)进行缺糖和缺氧处理模拟脑缺血损伤。线粒体可以生成ATP为细胞提供能量。线粒体内蛋白酶Htr A2/OMI、LONP、CLPP等,可使线粒体内未折叠蛋白反应(UPR)增强,去除多余的蛋白质恢复线粒体的功能,对于维持细胞稳态发挥重要的作用。线粒体功能障碍与线粒体不能满足细胞对ATP需求有关,并且活性氧生成增强。当线粒体受到损伤时,会导致线粒体内蛋白酶Htr A2/OMI等从线粒体释放出来,从而裂解XIAP,促进凋亡的发生。研究表明,当蛋白质发生损坏时会对内质网(ER)稳态产生不利影响,从而导致ER应激,这反过来启动了未折叠蛋白反应(UPR),这是一种整合的细胞内信号通路,通过增加ER分子伴侣的表达、减弱整体蛋白质翻译和降解未折叠蛋白来响应ER应激,当内质网受损伤时会激发PERK/e IF2α-ATF4-ATF5-CHOP经典途径引起内质网应激。线粒体自噬的经典途径为PINK/PARKIN途径。当线粒体膜电位下降时,PINK在线粒体外膜上表达,募集磷酸化的PARKIN进而结合泛素基团,进而结合线粒体自噬相关蛋白引起自噬,清除不健康的线粒体。线粒体是一种重要的细胞器,在不同的生命功能中起着关键作用,例如能量产生、Ca稳态、碳代谢、细胞生长中间体的产生以及诱导细胞凋亡。研究目的:本研究通过复制HT22小鼠海马神经元细胞缺糖缺氧模型,以线粒体应激和内质网应激为切入点,探讨内质网和线粒体应激共同诱导线粒体自噬在细胞损伤过程中发挥的保护作用。研究方法:通过对HT22细胞进行缺氧糖剥夺处理用无糖的DMEM培养基在缺氧箱(O0.5%,CO5%)同时加Genipin处理分为Con组、OGD组、OGD+Genipin组。1.通过MTT、流式细胞仪检测凋亡、Hoechst染色检测细胞核形态、Western Blot检测凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、c-caspase3的蛋白表达水平评估细胞的损伤情况。2.通过流式细胞仪JC-1染色检测线粒体的膜电势以及ROS,荧光显微镜观察线粒体内ROS,用Western Blot分别检测线粒体、胞浆及总蛋白中丝氨酸蛋白酶Htr A2/OMI线粒体蛋白酶LONP、CLPP的蛋白表达情况评估线粒体状态。3.通过Western Blot检测PERK、e IF2α、p-e IF2α、ATF4、ATF5内质网应激相关蛋白,评估内质网应激情况。4.通过Western Blot检测UCP2、PINK、PARKIN、LC3II/LC3I、P62等蛋白表达情况;加入自噬通量阻断剂氯喹(CQ)后,用Western Blot检测LC3II/LC3I、P62蛋白表达情况、流式细胞仪检测线粒体的数量,评价线粒体自噬通量是否通畅;IP检测UCP2、PARKIN、ATF4的蛋白表达情况,评估线粒体自噬与线粒体应激以及内质网应激的关系。结果:1.加入Genipin后,OGD+Genipin组细胞生存能力上升;流式细胞术检测细胞凋亡,OGD+Genipin组细胞凋亡率下降;Hoechst染细胞核后荧光显微镜显示,处理组核固缩、核碎裂形态减少;Western blot蛋白检测凋亡相关蛋白BAX以及下游c-caspase3,处理组表达量上升,在OGD+Genipin组表达下降,抗凋亡蛋白BCL-2在OGD+Genipin组表达上升。2.流式细胞仪检测JC-1、ROS结果显示,加入Genipin后线粒体膜电势提升,ROS的生成减少,荧光显微镜显示线粒体内ROS明显减少;Western Blot检测线粒体蛋白结果显示,加入Genipin后BAX表达降低,BCL-2表达上升,而总蛋白以及线粒体蛋白结果显示,Htr A2/OMI、线粒体蛋白酶LONP、CLPP在OGD组表达上升,在OGD+Genipin组表达进一步上升。3.Western Blot检测总蛋白中PERK、e IF2α、p-e IF2α、ATF4、ATF5、CHOP,在加药后表达上升更加明显,检测线粒体蛋白ATF5发现加药后表达上升更加明显。4.Western Blot检测总蛋白和线粒体蛋白,UCP2在处理后表达上升,加药后表达下降,线粒体自噬相关蛋白PINK、PARKIN、LC3II/LC3I在处理后表达上升,在加药后上升更加明显,P62蛋白表达变化不明显,线粒体蛋白内p-UB在处理后表达上升,加药后表达上升更加明显。RT-q PCR检测UCP2在

关键词：缺氧糖剥夺内质网应激线粒体应激 UCP2 线粒体自噬

ATF4/TRIB3途径调控线粒体应激促进肝星状细胞的激活

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

ATF4/TRIB3途径调控线粒体应激促进肝星状细胞的激活

作者：叶曼萍安徽医科大学

学位级别：硕士

目的：肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化是肝纤维化(liverfibrosis)发病进程中的中心环节，它直接导致肝组织纤维化病理改变。线粒体应激通过诱导正常细胞的异常改变而加剧炎症性疾病，然而线粒体应激在HSC激活中的作用仍... 详细信息

目的：肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化是肝纤维化(liverfibrosis)发病进程中的中心环节，它直接导致肝组织纤维化病理改变。线粒体应激通过诱导正常细胞的异常改变而加剧炎症性疾病，然而线粒体应激在HSC激活中的作用仍有待阐明。本研究中，我们在体外探究了线粒体应激对HSC活化的影响。本研究旨在探究转录激活因子4（transcriptionalactivator4,ATF4）是否通过上调Tribbl同源蛋白3（tribblehomologue3,TRIB3）诱导线粒体应激，从而激活HSC。　　方法：(1)采用10ng/mLPDGF-BB激活HSC-T6细胞，检测肝星状细胞中的α-SMA，ATF4，Collagen-1，CyclinD1和PCNA的表达;流式细胞术探测细胞周期分布，EDU染色标记增殖细胞数。(2)探究ATF4对HSCs活化增殖的影响，分别通过pcDNA3.1ATF4转染HSC-T6细胞来过表达ATF4和siRNA技术沉默ATF4，检测Collagen-1，α-SMA，CyclinD1，PCNA的表达，以及细胞周期的转化情况，EDU染色显示细胞增殖数来探究ATF4对HSC-T6细胞活化增殖的情况。(3)探究ATF4对线粒体应激的影响，在ATF4siRNA以及pcDNA3.1ATF4处理的HSC-T6细胞中，通过检测线粒体应激相关标志物HSP60、ClpP和LONP1的表达，透射电镜检测HSC-T6细胞中线粒体形态，流式测定细胞内ROS水平，激光共聚焦法测定线粒体ROS水平和线粒体膜电位，检测细胞内ATP含量，来探究对线粒体功能的影响。(4)探究线粒体应激和活化增殖的HSC-T6的关系，采用UPRmt的抑制剂azoramide和激活剂Erso处理HSC-T6细胞，检测对其活化增殖能力的影响。(5)探究ATF4与TRIB3的关系，通过沉默和过表达ATF4观察TRIB3的表达，并且CHIP-PCR实验验证ATF4与TRIB3之间的关系。(6)检测沉默和过表达TRIB3对HSC-T6活化增殖以及线粒体功能的影响。　　结果：(1)ATF4在活化的HSC-T6细胞中高表达。(2)沉默ATF4后可阻碍HSC-T6的活化增殖，主要表现在Collagen-1，α-SMA，CyclinD1，PCNA的表达降低，并且阻碍了活化的HSC-T6细胞从G0/G1期到S期的过渡，EDU阳性细胞数减少，过表达ATF4则促进了其活化增殖。(3)沉默ATF4后改善线粒体应激，主要表现在降低了HSP60、ClpP和LONP1的表达，减轻了线粒体肿胀、嵴破裂、空泡化等损伤，抑制了细胞和线粒体ROS水平的升高，改善了升高的膜电位，降低了ATP含量;过表达ATF4则促进了线粒体应激反应。(4)UPRmt的抑制剂azoramide抑制了HSC-T6细胞的活化增殖，激活剂Erso促进了HSC-T6细胞的活化增殖。(5)沉默ATF4下调了TRIB3的表达，过表达ATF4上调了TRIB3的表达，CHIP-PCR结果显示ATF4与TRIB3启动子的一个特定区域（903--762bp）直接结合。(6)在HSC-T6细胞中沉默TRIB3后，Collagen-1，α-SMA，CyclinD1，PCNA，HSP60、ClpP和LONP1表达均降低，过表达TRIB3则其相关蛋白表达升高。　　结论：(1)ATF4参与调节肝星状细胞中的线粒体应激反应。(2)ATF4参与的线粒体应激可以诱导肝星状细胞的活化。(3)TRIB3作为ATF4下游靶基因，参与了ATF4促进线粒体应激的肝星状细胞活化。

关键词：肝纤维化肝星状细胞线粒体应激转录激活因子4 Tribbl同源蛋白3

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

线粒体应激与细胞蛋白稳态和适应

解剖科学进展 2023年第5期29卷 555-557,560页

作者：李倩竹王梦伊张世武舒凤张伟华哈尔滨医科大学病理生理学教研室黑龙江哈尔滨150080

线粒体是细胞内氧化磷酸化(OXPHOS)和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,在维持细胞存活,细胞死亡和细胞代谢稳态方面发挥重要作用。当线粒体功能受到干扰时,许多重要的生命过程会受到损害,导致许多疾病的发生。因此,维持线粒体完整性和稳... 详细信息

线粒体是细胞内氧化磷酸化(OXPHOS)和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,在维持细胞存活,细胞死亡和细胞代谢稳态方面发挥重要作用。当线粒体功能受到干扰时,许多重要的生命过程会受到损害,导致许多疾病的发生。因此,维持线粒体完整性和稳态对于确保细胞和有机体生存至关重要。在应激作用下,线粒体通过诱导一系列的细胞反应来减少应激带来的不良后果,包括线粒体未折叠蛋白反应(UPR^(mt))向细胞核传递受到应激的线粒体信号。关闭蛋白质翻译,以及其他细胞质蛋白网络的稳定对于恢复线粒体功能也非常重要,如线粒体前体过度积累应激(mPOS)。

关键词：线粒体功能应激作用细胞反应细胞蛋白细胞死亡细胞存活蛋白质翻译线粒体应激

线粒体应激参与慢性乙型肝炎肝损伤的机制研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

肝脏 2023年第7期28卷 743-746页

作者：张明明汪艳广东省肝纤维化工程技术研究中心广州510515 南方医科大学中心实验室南方医科大学药学院

慢性乙型肝炎仍是一个重要的公共卫生问题。近年来,肝线粒体相关变化作为肝纤维化中的重要角色受到关注,而HBV感染可引起肝线粒体代谢功能障碍、mtDNA损伤释放、线粒体动力学异常等线粒体应激表现。本文主要对肝线粒体应激影响HBV慢性... 详细信息

慢性乙型肝炎仍是一个重要的公共卫生问题。近年来,肝线粒体相关变化作为肝纤维化中的重要角色受到关注,而HBV感染可引起肝线粒体代谢功能障碍、mtDNA损伤释放、线粒体动力学异常等线粒体应激表现。本文主要对肝线粒体应激影响HBV慢性病程的机制研究进行综述。

关键词：乙型肝炎病毒慢性乙型肝炎肝纤维化线粒体应激

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

内质网应激下的内质网-线粒体互作

中国科学：生命科学 2022年第1期52卷 46-57页

作者：王立堃中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室北京100101

内质网(endoplasmic reticulum, ER)在蛋白质质量控制体系中占据极其重要的地位.当未折叠和错误折叠蛋白质在ER中累积,会导致所谓"ER应激",进而启动未折叠蛋白响应(unfolded protein response, UPR)以恢复蛋白质稳态.如果ER应激不能得... 详细信息

内质网(endoplasmic reticulum, ER)在蛋白质质量控制体系中占据极其重要的地位.当未折叠和错误折叠蛋白质在ER中累积,会导致所谓"ER应激",进而启动未折叠蛋白响应(unfolded protein response, UPR)以恢复蛋白质稳态.如果ER应激不能得到缓解, UPR也会启动凋亡途径,清除累积大量错误折叠蛋白的细胞.近年来,随着对细胞器互作研究的深化,人们发现ER应激所影响的细胞器并不仅限于ER本身,而UPR的调控也不全依赖于ER这一细胞器,而是与多种其他细胞器有着密切联系.这其中,线粒体因其与ER有着广泛而紧密的互作而受到广泛关注.本文将介绍ER应激和UPR对ER-线粒体互作的调控以及这种互作如何影响UPR.

关键词：内质网应激未折叠蛋白响应线粒体应激内质网-线粒体互作 MAM

基于“脾藏营”理论探讨健脾助运法干预糖尿病胃轻瘫线粒体应激研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

陕西中医 2022年第2期43卷 223-226页

作者：郭倩万生芳何蕴良马欣欣王同亮张磊舒畅李亚玲杨雅丽甘肃中医药大学甘肃兰州730000

“脾藏营”理论来源于《黄帝内经》,其本质是脾主转运。脾的正常转运是脾藏营功能正常的基础,是五脏六腑畅达的重要生理环节。脾藏营失司则脾营不足、脾营不运,机体代谢异常。糖尿病胃轻瘫是一种常见的代谢性疾病,以脾失健运,气机升降... 详细信息

“脾藏营”理论来源于《黄帝内经》,其本质是脾主转运。脾的正常转运是脾藏营功能正常的基础,是五脏六腑畅达的重要生理环节。脾藏营失司则脾营不足、脾营不运,机体代谢异常。糖尿病胃轻瘫是一种常见的代谢性疾病,以脾失健运,气机升降失常为基本病机,病程日久引起脾不升,胃不降,以胃动力障碍,胃排空延迟为主要临床表现,即脾藏营失司是糖尿病胃轻瘫核心病理环节。线粒体应激是糖尿病胃轻瘫的重要发病机制,线粒体是物质能量代谢的核心细胞器与中医学之“脾”具有异曲同工之妙,健脾助运法能调节线粒体应激,恢复脾藏营功能,改善糖尿病胃轻瘫的临床症状。因此本文基于“脾藏营”理论探讨健脾助运法调节线粒体应激、恢复线粒体稳态,治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制。

关键词：糖尿病胃轻瘫脾藏营脾主转运脾藏营失司线粒体应激健脾助运法

线粒体应激与p53转位诱导肝源细胞凋亡机制的研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

线粒体应激与p53转位诱导肝源细胞凋亡机制的研究

作者：于卫华第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】研究表明，酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、药源性肝炎及肝癌等多种肝病都与氧化应激有关。肝损伤的重要表现之一是发生肝细胞凋亡，研究肝细胞凋亡既是防治肝损伤的需要，也对诱导肿瘤细胞凋亡具有借鉴意义。P53作为重要的应激... 详细信息

【背景】研究表明，酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、药源性肝炎及肝癌等多种肝病都与氧化应激有关。肝损伤的重要表现之一是发生肝细胞凋亡，研究肝细胞凋亡既是防治肝损伤的需要，也对诱导肿瘤细胞凋亡具有借鉴意义。P53作为重要的应激传感器，在ROS等不利因素的刺激作用下可诱导细胞发生凋亡。研究发现，细胞一旦出现氧化应激，p53就会大量表达，启动细胞凋亡。但是，p53是通过哪些作用因素或途经诱导细胞凋亡的，目前尚不完全清楚。最近有研究发现，在凋亡因子刺激下，p53可能转位到线粒体发挥作用。而线粒体作为能量生产场所，也是自由基、活性氧（ROS）衍生的主要部位，同时又可能是ROS攻击的主要靶点。然而，p53和线粒体以及细胞凋亡三者之间关系如何，至今仍然还是个“谜团”。葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX），能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与细胞内游离的氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）。由于GOX的催化底物葡萄糖和氧气在体内含量丰富，葡萄糖氧化酶催化ROS生成体系既是细胞内存在的常见反应，也可以作为一个生理环境下H2O2释放的理想模型。因此，采用GOX催化细胞内β-D-葡萄糖以产生内源性ROS，观察p53和线粒体相关因子的变化，研究凋亡发生与调控过程，以期阐明p53参与诱导肝凋亡的可能机制，为肝损伤防治研究提供新的思路。【目的】本项目通过葡糖糖氧化酶系统从体内和体外水平诱导肝细胞产生氧化应激，观察细胞和线粒体中ROS水平变化;研究ROS是否能够引起线粒体膜通道孔开放与膜电位改变，以及诱导p53的线粒体转位;探讨p53、线粒体应激和肝源细胞凋亡的关联性。具体研究目的如下： 1．观察是否存在线粒体应激和p53线粒体转位，并探讨二者间的关联性。 2．研究线粒体氧化应激过程中线粒体膜通透性和膜电位的变化。 3．探讨线粒体应激条件下p53参与肝源细胞凋亡的调控过程。【方法】以HepG2细胞（人肝癌细胞）和Babl/c小鼠为研究对象，实验分为：(A)正常对照组、(B)GOX处理组、(C)PFT+GOX组、(D)CsA+GOX组。研究肝细胞线粒体氧化应激，线粒体膜结构与功能破坏，p53表达和亚细胞定位及凋亡相关分子变化。同时采用p53抑制剂（Pifithrin-a， PFT）与线粒体膜通道孔抑制剂（Cyclosporine A，CsA），进一步观察p53对线粒体氧化应激、线粒体膜的功能及凋亡相关因子的抑制作用;深入研究线粒体应激与p53线粒体转位参与调控细胞凋亡机制。 1．细胞水平实验：采用HepG2细胞系作为实验对象，利用葡萄糖+葡萄糖氧化酶ROS生成系统。采用免疫荧光和亚细胞蛋白免疫印迹法，研究ROS对肝细胞p53蛋白含量和亚细胞定位的影响。测定线粒体中超氧阴离子自由基清除剂MnSOD表达，并使用Mito-SOXTM为探针测定线粒体ROS的生成。测定线粒体膜电位，线粒体膜通透性改变，线粒体细胞色素c释放，研究线粒体功能改变。提取线粒体、细胞质和细胞核，从整体和亚细胞水平分析细胞或组织中凋亡相关蛋白，如细胞色素c、bax、caspase3、caspase9、p53蛋白水平变化，以及氧化还原蛋白MnSOD变化。探讨氧化应激、p53水平、线粒体结构功能及肝源细胞凋亡之间的关系。 2．动物水平实验：在完成细胞学研究的基础上，采用Balb/C小鼠作为研究对象，通过小鼠尾静脉射葡萄糖氧化酶，诱导小鼠肝脏的急性氧化损伤，并通过尾静脉给予Pifithrin-α和Cyclosporine A处理，生理盐水作为对照。主要观察指标如下：处理完成后，取出小鼠肝组织，测定氧化还原、p53蛋白定位、膜损伤、细胞凋亡等指标的的变化，测定方法与细胞实验一致。【结果】 (1)给予一定剂量葡萄糖氧化酶处理后，HepG2细胞活力明显降低，细胞内ROS、MDA水平升高和GSH含量降低。MnSOD蛋白表达水平降低，Mito-SOXTM染色后线粒体超氧阴离子自由基水平显著升高，线粒体出现了氧化应激状态。 (2) GOX处理后HepG2细胞p53表达水平明显升高， p53大量向线粒体聚集，与以往文献报道不同的是细胞核和细胞浆内p53水平无明显变化。 (3) GOX处理后线粒体膜电位降低和膜通透性转运孔开放，细胞色素c由线粒体释放至细胞质中， Bax也由细胞浆向线粒体聚集，caspase-9、caspase-3激活。而AnnexinV/PI双染和TUNEL阳性率增加，表明大量细胞凋亡。 (4)动物实验表明，葡萄糖氧化酶导致小鼠肝细胞线粒体MDA和ROS水平升高，GSH水平降低。尤其是p53水平上调并伴有线粒体转位，抗氧化酶MnSOD表达与活性降低，肝细胞大量凋亡。 (5)给予p53抑制剂PFT（Pifithrin-α）和线粒体膜通道孔开放抑制剂CsA（Cyclosporine A）处理均可以一定程度上抑制HepG2细胞和小鼠肝脏p53的转位，修复或减轻线粒体应

关键词： p53 活性氧线粒体应激肝细胞凋亡线粒体膜通透性 MnSOD