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人类线粒体基因组克隆与体内递送

人类线粒体基因组克隆与体内递送

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作者：李冠初大连医科大学

学位级别：硕士

背景:细胞的大部分能量是线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）产生的,需要氧气和可氧化的碳源。以葡萄糖为例,代谢为二氧化碳和水的过程中会产生几种高能中间产物。线粒体基因中的致癌突变会影响三羧酸循环的正常功能... 详细信息

背景:细胞的大部分能量是线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）产生的,需要氧气和可氧化的碳源。以葡萄糖为例,代谢为二氧化碳和水的过程中会产生几种高能中间产物。线粒体基因中的致癌突变会影响三羧酸循环的正常功能,说明这些中间产物的生成与线粒体基因组的状态有关。并非所有肿瘤都存在氧化磷酸化缺陷（OXPHOS defeat）。每个细胞有几百到几千个线粒体dna,执行部分氧化磷酸化功能,其余氧化磷酸化所需基因在细胞核基因组中,大约有1000-2000个核基因编码线粒体基因。哺乳动物的线粒体中含有13个OXPHOS的关键基因,以及t RNA和核糖体RNA。有分析显示,癌症中改变的基因在正常人的线粒体中也存在。故产生了一个假说,线粒体变异有两类:导致癌症的严重突变和细胞适应性的温和突变。临床相关的线粒体突变主要有三类:第一种是母系生殖系统中的变异。最初这些变体出现在正常线粒体为主细胞中,产生了正常和变异线粒体混合的“异质性”细胞质。第二类临床相关的线粒体dna变异发生在卵母细胞中、发育过程中或身体的组织中。包括碱基替换和缺失,并且会随着年龄增长而积累。第三种临床相关的线粒体dna变异是发生在长时间的积累中,发生在人类从非洲到世界各地的物种迁移中。由于时间更加久远,他们在各个族群中显示出同质化的状态。并在新环境中进行了自然选择。目前已有的基因编辑,包括ZFN、TALEN、CRISPRE等方法不能很好的作用于线粒体dna的编辑。胞质杂交技术（Cybrid）简单有效,但是该研究方案受限于只能依赖已经产生的突变细胞系,而不能自由编辑线粒体dna,也容易受到细胞系中其它突变基因的干扰,缺乏自由度和可靠性。而线粒体dna多个基因位点已经报道与许多疾病相关,却缺乏自由可靠的基因编辑手段来进行研究。因此,实现线粒体基因组的自由编辑会对包括肿瘤在内的相关疾病在基因水平上有更深的理解。本研究将以具有强内吞能力的HEK293T细胞系作为受体细胞,开发人工线粒体dna合成与递送技术。针对该细胞系线粒体dna单倍型及异质性位点分布,设计并合成适配HEK293T细胞的人工线粒体dna。目的:1.如何利用基于自身正常线粒体的dna合成与递送到细胞,并取代已发生突变的异常线粒体dna。2.利用此套技术路线实现线粒体dna的自由编辑。方法:以人类全长16569bp的线粒体基因组为研究对象1.应用PCR法,对于人类线粒体基因组dna上含有3个Eco RI的酶切位点,使用含有突变位点的PCR引物进行PCR反应,获取含有m.5280C>T,m.4125U>C,m.12645C>T同义突变的dna片段。2.应用PCR产物琼脂糖电泳凝胶回收法,获取提纯的含有m.5280C>T,m.4125U>C,m.12645C>T同义突变的dna片段。3.应用融合PCR法,对人类线粒体基因组dna上的m.2939C>A,m.2991T>C突变,使体外合成的人类线粒体基因组dna带有氯霉素抗性。4.应用酿酒酵母同源重组法,将回收产物到酿酒酵母BY4741中与PRS415载体进行同源重组,来达成m.5280C>T,m.4125U>C,m.12645C>T同义突变,使新的线粒体dna上不再含有Eco RI酶切位点。5.应用PCR法,对转入了突变完成的线粒体dna的酿酒酵母菌进行质粒提取,作为模板来进行PCR,将PCR产物进行琼脂糖电泳凝胶回收获取全长16569bp的线状人类线粒体dna。6.应用本研究小组自行设计的线性dna环化法,将全长16569bp的线状人类线粒体dna不引入额外序列,环化成仍然全长16569bp的环形人类线粒体dna。7.应用dna磁珠分选法（dna selection beads）,获取纯化的环形人类线粒体dna。8.应用慢病毒转染法,将含Eco RI限制性内切酶、带有m Cherry荧光蛋白标记和嘌呤霉素（Puromycin）抗性的p LVX载体质粒转入293T细胞。该质粒内带有细胞色素c氧化酶亚基8A（COX8A）能将Eco RI限制性内切酶和m Cherry荧光标记引定位导入线粒体内部,带有Tet-on表达调控系统,可以使用多西环素（Doxycycline）调节Eco RI限制性内切酶和m Cherry荧光蛋白表达与否。9.应用慢病毒转染法,将含有EGFP荧光蛋白标记的p LVX载体质粒转入293T细胞。10.应用流式筛选法,以m Cherry作为筛选标签,筛选成功转入目的基因的细胞。成功转入目基因的细胞内线粒体dna将被Eco RI限制性内切酶消化清除,成为无线粒体功能的ρ细胞。11.应用流式筛选法,以EGFP作为筛选标签,筛选成功转入目的基因的细胞。12.应用线粒体粗提取法,将293T细胞中细胞器粗提取,然后与本研究中体外合

关键词：人类线粒体dna 线性dna环化线粒体基因编辑

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