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病毒融合纺锤体移植对鼠重构卵纺锤体组装及胚胎发育的影响

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病毒融合纺锤体移植对鼠重构卵纺锤体组装及胚胎发育的影响

作者：李云飞河北医科大学

学位级别：硕士

目的:线粒体是机体能量代谢的动力工厂,高耗能器官如骨骼肌、心脏、中枢神经系统、内分泌系统、视网膜和肝脏等易受线粒体功能的影响。由于线粒体几乎不含对自身进行修复的监控系统,因此易发mt DNA突变,导致线粒体功能缺陷或障碍,引起... 详细信息

目的:线粒体是机体能量代谢的动力工厂,高耗能器官如骨骼肌、心脏、中枢神经系统、内分泌系统、视网膜和肝脏等易受线粒体功能的影响。由于线粒体几乎不含对自身进行修复的监控系统,因此易发mt DNA突变,导致线粒体功能缺陷或障碍,引起线粒体病如心脏病、糖尿病,衰老和卵巢功能减退等。本课题组具备线粒体功能障碍模型鼠Fus1 KO鼠使用权,因此,研究线粒体功能障碍模型鼠Fus1 KO鼠的卵巢储备功能,证实其具有卵巢功能减退表型,可以为线粒体功能障碍导致卵巢储备功能减退的机制研究提供数据支撑,同时也进一步拓宽Fus1 KO模型鼠的应用范畴。另外线粒体置换技术(Mitochondrial replacement techniques,MRT)被认为可能是目前唯一阻断线粒体遗传病代际传播的有效途径。纺锤体移植技术因其不涉及卵母细胞体外成熟培养,纺锤体周围无核膜包绕,取出含细胞核胞体携带残余突变线粒体少,优势明显。研究发现,电融合纺锤体移植技术构建重构卵易发染色体异常可能与电融合电刺激有关,而病毒融合对卵胞体刺激较小,因此本研究拟应用病毒融合纺锤体移植(Spindle transfer,ST)技术,检测纺锤体组装调控关键蛋白Bub1相关激酶(Bubl related kinase,Bub Rl)和第五天囊胚的染色体核型,比较取核前后对纺锤体组装关键蛋白Bub R1定位,纺锤体形态,染色体排列和分布以及胚胎发育的影响。为纺锤体移植技术对线粒体遗传病治疗过程中存在的安全性问题提供可靠的实验依据。方法:模型来源及意义:本实验用到的线粒体功能障碍小鼠模型来源于上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室;在此模型小鼠中,敲除基因Fus1后,Fus1蛋白丢失。Fus1蛋白主要与线粒体功能有关。由于线粒体蛋白Fus1的丢失,导致线粒体膜电位,钙摄取,呼吸储备,线粒体融合等参数的改变,造成线粒体功能障碍。1.Fus1 KO小鼠卵巢储备功能研究的方法1.1通过眼球取血法分别采取野生型(Wild type,WT)小鼠和Fus1KO小鼠的眼球血,化学发光法定量测定血清中的孕激素(Progesterone,P),雌二醇(Estradiol,E),抗缪勒管激素(Anti mullerian hormone,AMH)水平。1.2将野生型(WT)小鼠和Fus1 KO小鼠分别脱臼处死,称取小鼠体重,快速地找到双侧卵巢,把卵巢周围的脂肪组织钝性分离后,将双侧的卵巢取出,称取卵巢的重量。1.3将卵巢组织进行HE染色,观察卵巢的组织形态并统计初级卵泡和次级卵泡数目。2.病毒融合纺锤体移植对重构胚发育,纺锤体组装,染色体的排列与分布影响研究的方法2.1通过体外受精观察对照组和病毒融合后重构卵组的胚胎发育情况,分别统计两组小鼠卵的受精率、卵裂率、囊胚率、孵化率。2.2免疫荧光化学法检测病毒融合纺锤体移植取核前,取核后和融合后纺锤体组装关键蛋白Bub Rl的定位,纺锤体形态,染色体排列与分布,统计Bub R1定位正常率、纺锤体形态正常率、染色体未分离率。2.3将对照组和病毒融合后重构卵组进行体外受精后,检测对照组和病毒融合后重构卵组第五天囊胚染色体核型是否异常,统计染色体核型异常率。结果:1.Fus1 KO小鼠卵巢储备功能的研究1.1将8周龄、12周龄、20周龄、68周龄、74周龄的Fus1 KO小鼠和WT小鼠的体重和卵巢的重量进行比较,发现实验组和对照组之间没有显著统计学差异(P>0.05);1.2检测8周龄、12周龄、20周龄、68周龄、74周龄的Fus1 KO小鼠和WT小鼠的P、E、AMH水平,发现8周龄和12周龄的Fus1 KO小鼠的P、E、AMH值均显著低于WT小鼠组(P0.05);1.3 8周龄,12周龄的Fus1 KO小鼠的初级卵泡和次级卵泡数均低于WT小鼠组(P0.05);68周龄,74周龄的Fus1 KO小鼠的初级卵泡和次级卵泡数和WT小鼠组相比,没有显著统计学差异(P>0.05);2.病毒融合纺锤体移植对重构胚发育,纺锤体组装,染色体的排列与分布影响2.1对照组和病毒融合后重构卵组之间的受精率、卵裂率、孵化率分别进行比较,没有显著统计学差异(P>0.05);对照组的囊胚率显著高于病毒融合后重构卵组(P纺锤体移植取核前组,取核后组和融合后组之间的Bub R1定位正常率、纺锤体形态正常率、染色体未分离率分别进行比较,发现均没有显著统计学差异(P>0.05);2.3将对照组和病毒融合后重构卵组的第五天囊胚核型异常率相比,没有显著统计学差异(P>0.05)。结论:1.

关键词：线粒体遗传病卵巢储备功能病毒融合纺锤体移植纺锤体组装

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14-3-3ε调节小鼠受精卵纺锤体组装

生殖与避孕 2015年第5期35卷 283-288页

作者：崔城秦鑫纪晓菁杨裕鑫于秉治中国医科大学基础医学院生理学教研室沈阳110122 中国医科大学沈阳110122 中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室沈阳110122

目的:研究14-3-3ε蛋白调节小鼠受精卵纺锤体组装的作用。方法:采用间接免疫荧光实验检测1-细胞期受精卵14-3-3ε和α-微管蛋白的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsi RNA注射入1-细胞期受精卵,观察小鼠受精卵纺锤体形态及检测Pol... 详细信息

目的:研究14-3-3ε蛋白调节小鼠受精卵纺锤体组装的作用。方法:采用间接免疫荧光实验检测1-细胞期受精卵14-3-3ε和α-微管蛋白的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsi RNA注射入1-细胞期受精卵,观察小鼠受精卵纺锤体形态及检测Polo样激酶1(Plk1)的活性。结果:14-3-3ε和α-微管蛋白在G1期、S期和G2期卵中主要共定位于细胞质,M期卵14-3-3ε主要位于细胞质皮质。小鼠受精卵注射14-3-3εsi RNA后导致异常形态纺锤体形成及Plk1活性下降。结论:14-3-3ε蛋白在调节小鼠受精卵纺锤体组装中发挥重要作用。

关键词： 14-3-3ε蛋白小鼠受精卵纺锤体组装 Polo样激酶1(Plk1)

MERIT40-Tankyrase1相互作用对纺锤体组装影响的研究

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MERIT40-Tankyrase1相互作用对纺锤体组装影响的研究

作者：谢旺清深圳大学

学位级别：硕士

高等真核细胞通过有丝分裂复制后的两条染色体通过染色体分离的方式精确分配到两个子代细胞中,对维持基因组稳定性起着常重要的作用。有丝分裂依赖于微管为基础的双极纺锤体的组装和功能。细胞内多种蛋白翻译后修饰参与了这个过程的严... 详细信息

高等真核细胞通过有丝分裂复制后的两条染色体通过染色体分离的方式精确分配到两个子代细胞中,对维持基因组稳定性起着常重要的作用。有丝分裂依赖于微管为基础的双极纺锤体的组装和功能。细胞内多种蛋白翻译后修饰参与了这个过程的严密调控,包括磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等。其中,泛素化是最为重要的一种蛋白质翻译后修饰,可调控蛋白质分子的定位、转运和相互作用,参与包括有丝分裂在内的诸多生物学过程。与其它翻译后修饰一样,泛素化是一个动态可逆的过程,泛素分子或泛素链可以被去泛素化酶水解,从而调控蛋白分子的泛素化水平和功能。BRISC是一个K63连接特异的去泛素化酶,由MERIT40、BRCC36、BRCC45和ABRO1组成,参与细胞内多个生物过程,如抗病毒免疫调控、炎性反应和纺锤体组装等。但它在纺锤体组装中的作用和机制还不是十分清楚。我们通过免疫荧光、免疫共沉淀、Pull Down、western blot等实验研究发现:(1)Tankyrase 1与MERIT40、BRCC36相互作用并定位于纺锤极;(2)RXXPEG是MERIT40纺锤极定位、MERIT40与Tankyrase 1相互作用必需的;(3)Tankyrase 1的亚结构域ARC V在Tankyrase 1与MERIT40-BRCC36相互作用中起主要作用;(4)MERIT40的RXXPEG突变体R28A呈现有丝分裂表型缺陷(5)Tankyrase 1在有丝分裂期可以被K63连接泛素化修饰,其修饰水平受MERIT40去泛素化酶复合物负性调控。RXXPEG突变削弱或破坏MERIT40与Tankyrase 1的相互作用,引起Tankyrase 1的K63连接泛素化水平显著增高,这可能进一步导致其PAR修饰酶活性失调,最终影响细胞纺锤体组装功能。

关键词：纺锤体组装泛素化 MERIT40 BRCC36 Tankyrase1

上海科学家与美国科学家合作揭秘纺锤体组装机理

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生物学教学 2009年第10期34卷 72-72页

据2009年2月11日《上海科技报》消息，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞研究所朱学良研究员与美国华盛顿卡耐基研究所郑诣先教授的一项合作研究揭示：与细胞运动相关的Nudel蛋白和素有“分子马达”之称的胞质动力蛋白，在纺锤体... 详细信息

据2009年2月11日《上海科技报》消息，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞研究所朱学良研究员与美国华盛顿卡耐基研究所郑诣先教授的一项合作研究揭示：与细胞运动相关的Nudel蛋白和素有“分子马达”之称的胞质动力蛋白，在纺锤体基质组装中发挥重要作用，并能调节纺锤体的正确形成。该成果已在2月9日《自然·细胞生物学》杂志在线发表。

关键词：纺锤体组装美国科学家上海合作机理动力蛋白细胞运动科学研究院

Aurora激酶A调控卵母细胞减数分裂的分子机制

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中国医学科学院学报 2022年第1期44卷 142-148页

作者：刘凤姚波莫晓龙柳琼友任艳萍遵义医科大学基础医学院组织胚胎学教研室贵州遵义563000

Aurora激酶A(AURKA)是Aurora激酶家族成员,其参与有丝分裂进入、中心体成熟和分离、双极纺锤体组装和稳定以及染色体的凝集和分离。AURKA在减数分裂过程中发挥的作用与有丝分裂类似,但其具体作用机制以及其与有丝分裂的异同尚不清楚。... 详细信息

Aurora激酶A(AURKA)是Aurora激酶家族成员,其参与有丝分裂进入、中心体成熟和分离、双极纺锤体组装和稳定以及染色体的凝集和分离。AURKA在减数分裂过程中发挥的作用与有丝分裂类似,但其具体作用机制以及其与有丝分裂的异同尚不清楚。因此本文从AURKA在卵母细胞减数分裂中的定位与活化,及其在调控纺锤体形成、纺锤体组装检查点活化以及动粒-微管附着纠错等方面进行综述,对比AURKA在有丝分裂和卵母细胞减数分裂中的异同,为今后进一步揭示细胞分裂调控机制以及癌症和生殖等相关临床研究奠定理论基础。

关键词：减数分裂 Aurora激酶A 微管组织中心纺锤体组装动粒-微管附着卵母细胞

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排卵后体外老化损伤卵母细胞质量的机制探究

排卵后体外老化损伤卵母细胞质量的机制探究

作者：宫雨田内蒙古大学

学位级别：硕士

卵母细胞排卵后老化主要分为体外老化与体内老化,老化后的卵母细胞对受精效率及之后的早期胚胎发育产生影响,进而导致辅助生殖技术的成功率降低。但是排卵后卵母细胞老化导致卵母细胞质量下降的分子机制仍不清楚,值得我们进一步探究。... 详细信息

卵母细胞排卵后老化主要分为体外老化与体内老化,老化后的卵母细胞对受精效率及之后的早期胚胎发育产生影响,进而导致辅助生殖技术的成功率降低。但是排卵后卵母细胞老化导致卵母细胞质量下降的分子机制仍不清楚,值得我们进一步探究。在本研究中,我们将6周ICR（Institute of Cancer Research）雌性小鼠腹腔注射h CG（Human chorionic gonadotropin）超排后14h取得的卵母细胞,并在体外培养老化24h后作为实验对象,首先通过蛋白免疫印迹、体外受精、卵母细胞免疫荧光染色等实验技术探究排卵后体外老化卵母细胞的表型;其次利用蛋白质谱和转录组技术挖掘体外排卵后老化导致卵母细胞质量下降的关键蛋白;最后,利用显微注射技术对影响排卵后体外老化的关键蛋白进行过表达,进一步探究卵母细胞排卵后体外老化的机制。主要结果如下:（1）通过表型探究实验我们发现,排卵后体外老化导致卵母细胞内活性氧含量显著升高,纺锤体组装受损,线粒体分布异常且非整倍体率增加,碎卵率明显升高等表型,进而影响受精后早期胚胎的发育;（2）蛋白质谱测序结果显示排卵后体外老化组卵母细胞与新鲜组卵母细胞之间存在的差异蛋白有121个,通过GO功能注释及KEGG通路富集分析发现这些差异蛋白主要富集在剪接复合体、细胞周期、核质运输、内质网中蛋白质加工过程、卵母细胞减数分裂等通路上,且转录组测序结果与蛋白质谱结果基本一致。我们在差异蛋白中筛选了卵母细胞母源mRNA降解相关蛋白DCP1A,YBX2和减数分裂纺锤体组装相关蛋白SPDL1,TTK,并从这两个方面探究排卵后体外老化卵母细胞质量下降的机制。（3）与新鲜组卵母细胞相比,排卵后体外老化卵母细胞中DCP1A的表达量显著升高,而YBX2的表达量显著降低。经过显微注射过表达实验证明了过表达DCP1A会导致卵母细胞母源mRNA加速降解。此外,SPDL1的表达量在排卵后体外老化组中有不同程度的降低,且过表达实验结果表明通过显微注射过表达SPDL1蛋白可以在一定程度上挽救排卵后体外老化带来的纺锤体组装紊乱以及染色体排列异常等现象。综上所述,排卵后卵母细胞老化造成的母源mRNA降解过程中,DCP1A和YBX2蛋白发挥重要作用,并影响早期胚胎发育。其次,排卵后卵母细胞纺锤体形态异常可能是由于以SPDL1为中心的纺锤体组装检验点受损,影响TTK等微管蛋白并损害细胞纺锤体迁移和染色体分离,导致卵母细胞纺锤体异常组装和非整倍性增加。这些结果为卵母细胞排卵后体外老化的相关研究提供了新的依据,对提高辅助生殖的成功率具有一定的指导意义。

关键词：染色体分离母源mRNA 排卵后体外老化纺锤体组装

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

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中国畜牧兽医 2019年第4期46卷 1094-1100页

作者：韩玉萍曹俊国杨镒峰许保增中国农业科学院特产研究所长春130112

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他... 详细信息

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。

关键词：纺锤体检查点减数分裂有丝分裂纺锤体组装细胞分裂

DNA损伤修复蛋白KU70在有丝分裂间期和有丝分裂期的调控作用机制研究

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DNA损伤修复蛋白KU70在有丝分裂间期和有丝分裂期的调控作用机制...

中国毒理学会第九次全国青年科技大会暨第二届生物技术药物...

作者：文思慧胡倩华粟智谢颖湖南师范大学分子流行病学湖南省重点实验室

目的作为重要的DNA损伤修复蛋白,研究KU70在细胞间期调节DNA损伤修复,以及在有丝分裂期对纺锤体稳定性和染色体分离的调控作用机制。材料与方法以不同浓度和时间博来霉素(Bleo)染毒HeLa细胞构建细胞DNA损伤细胞模型,观察KU70蛋白水平的... 详细信息

目的作为重要的DNA损伤修复蛋白,研究KU70在细胞间期调节DNA损伤修复,以及在有丝分裂期对纺锤体稳定性和染色体分离的调控作用机制。材料与方法以不同浓度和时间博来霉素(Bleo)染毒HeLa细胞构建细胞DNA损伤细胞模型,观察KU70蛋白水平的变化。免疫共沉淀观察KU70与CRL E3泛素连接酶亚基CUL4的交互作用。siRNA干预RBX1表达后,观察对KU70的泛素化修饰和蛋白稳定性的影响。细胞克隆和CCK-8实验观察敲低RBX1对DNA损伤后细胞增殖的影响。将HeLa细胞同步化至不同的细胞周期,检测DNA损伤后KU70在细胞间期和有丝分裂期的蛋白水平。免疫荧光法观察KU70和RBX1蛋白在有丝分裂期中心体、纺锤体和中间体等亚细胞器的定位。RBX1对有丝分裂期KU70蛋白在不同亚细胞器的招募,以及干预RBX1和KU70对染色体正确分离,多核细胞和蝴蝶核细胞形成的影响。结果 4μM Bleo处理细胞1h后KU70蛋白增加,3h后蛋白水平下降,而RBX1蛋白先减少后增加,呈现负相关趋势。KU70蛋白与CRLE3泛素连接酶的CUL4亚基存在交互作用。RBX1上调CUL4的类泛素化修饰,促进KU70的泛素化降解。敲低RBX1后,KU70的泛素化修饰减少,CHX抑制蛋白质合成后,蛋白稳定性增加。与Bleo染毒细胞相比,敲低RBX1联合Bleo处理后细胞生存率进一步下降。另外,Bleo染毒3h后KU70蛋白降低不仅发生在G0/G1期,也发生在G2/M期细胞中。在细胞有丝分裂期观察到,敲低RBX1干预KU70蛋白执行纺锤体组装功能,进而影响染色体正确分离,多核细胞和蝴蝶核细胞比例增加,加重DNA损伤。结论 RBX1通过上调CUL4的类泛素化修饰促进KU70的泛素化降解,在细胞间期介导KU70蛋白从DSB末端解离,便于后续NHEJ修复蛋白的结合,在有丝分裂期调控纺锤体组装和染色体分离,维持染色体的稳定性。

关键词： KU70蛋白泛素化降解 DNA损伤修复有丝分裂纺锤体组装

来源： cnki会议评论

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小G蛋白Ran在细胞周期调控中的作用

科学通报 2011年第30期56卷 2472-2477页

作者：刘佩伟齐洺任海云北京师范大学生命科学学院细胞增殖与调控生物学教育部重点实验室北京100875

Ran(Ras-Related Nuclear Protein)作为小G蛋白家族的一类,具有GTP水解酶的功能,在细胞内行使"分子开关"的作用.利用酵母和脊椎动物细胞的研究结果表明,Ran参与细胞间期的核质运输、细胞分裂前期的纺锤体组装和细胞分裂末期的核膜重建... 详细信息

Ran(Ras-Related Nuclear Protein)作为小G蛋白家族的一类,具有GTP水解酶的功能,在细胞内行使"分子开关"的作用.利用酵母和脊椎动物细胞的研究结果表明,Ran参与细胞间期的核质运输、细胞分裂前期的纺锤体组装和细胞分裂末期的核膜重建等过程.虽然在高等植物细胞中,关于Ran功能的研究报道还十分有限,但是近来利用不同模式植物的研究结果表明,在多种植物细胞中,Ran都参与了与细胞周期进程相关过程的调节.此外,也有研究表明Ran还影响生长素信号通路.因此,Ran蛋白在动物及植物等不同物种之间的功能具有一定保守性和特异性.

关键词： Ran 细胞周期核质运输纺锤体组装生长素 Ran结合蛋白