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河南工业大学学报（自然科学版） 2023年第4期44卷 98-105页

作者：索志光王琪璇吕泽平卫敏河南工业大学粮油食品学院河南郑州450001

为了达到方便、快速检测赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的目的,利用羧基荧光素(FAM)与黑洞猝灭基团(BHQ1)之间的荧光共振能量转移(FRET)作用,使用纸基作为传感器基底,构建了简单、低成本、易于长期保存的纸基生物传感器用于检测食品中... 详细信息

为了达到方便、快速检测赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的目的,利用羧基荧光素(FAM)与黑洞猝灭基团(BHQ1)之间的荧光共振能量转移(FRET)作用,使用纸基作为传感器基底,构建了简单、低成本、易于长期保存的纸基生物传感器用于检测食品中的赭曲霉毒素A。将可以特异性识别OTA的适配体(Apt-FAM)通过生物素和链霉亲和素之间的强相互作用连接在纸基上,当OTA存在时,OTA优先与Apt-FAM结合,与Apt-FAM互补的互补链(cDNA-BHQ1)不能通过碱基互补配对连接到纸基上,因而可获得较强的FAM荧光信号。当OTA不存在时,cDNA-BHQ1通过碱基互补配对与Apt-FAM结合,连接到纸基传感器表面,猝灭基团BHQ1靠近荧光基团FAM,通过FRET作用抑制荧光基团FAM的信号。在最佳检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为10~2000 ng/mL,线性方程为y=-15.85846+65.63138lg(C OTA)(R^(2)=0.995),最低检出限为1.2 ng/mL。该传感器能够成功用于检测米粉和绿豆饼样品中的OTA,其平均回收率分别为89.2%~111.0%和89.0%~103.0%。

关键词：赭曲霉毒素A 核酸适配体纸基生物传感器荧光共振能量转移

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基于酶水解聚合物构建纸基比距生物传感器检测生物标志物

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作者：赵冰璐齐鲁工业大学

学位级别：硕士

即时检测(Point-of-Care Testing,POCT)是一种使用便携式装置、在现场快速检测目标物的新兴技术,快速准确地输出检测信号是POCT技术最主要的优势,因此其常作为预检测手段给临床诊断提供预判和参考。不仅如此,成本低廉、试剂消耗量小和... 详细信息

即时检测(Point-of-Care Testing,POCT)是一种使用便携式装置、在现场快速检测目标物的新兴技术,快速准确地输出检测信号是POCT技术最主要的优势,因此其常作为预检测手段给临床诊断提供预判和参考。不仅如此,成本低廉、试剂消耗量小和用户友好性的POCT技术也给医疗资源匮乏地区带来了极大便利。生物传感器的问世给POCT技术带来了新的机遇,以生物识别分子和信号转换器构成的生物传感器具有小型化、便携化、智能化、高灵敏等的优点,是开发POCT新器件的良好分析平台。生物传感器的种类繁多,其中以纸为基底构建的生物传感器除了具有上述优势外又兼具经济友好和易功能化的特点,在开发POCT体外诊断生物传感器件中具有重要价值。当前已经有多款成熟的纸基生物传感器在市场上流通,如免疫胶体金妊娠试纸、新冠SARS-Cov-2抗原检测试纸、HIV检测试纸等。本论文以构建POCT纸基比距生物传感器快速检测生物标志物为研究目标,酶水解聚合物为基础,纸条为传感基底,开发了两种不同类型的以刺激响应聚合物为主要材料的纸基比距生物传感器,分别实现了透明质酸酶(HAase)、HAase抑制剂-单宁酸(TA)和α-淀粉酶(AMY)、AMY抑制剂-阿卡波糖的快速高灵敏检测,为新型纸基比距生物传感器的发展提供了新思路。本论文主要开展了以下两个研究工作:1.构建了一种无设备和无标记的纸基比距生物传感器,基于酶水解诱导的刺激响应聚合物溶液的粘度变化,引起将聚合物溶液在检测试纸上的流动距离发生改变,通过水流距离信号实现目标物的定量分析。以检测HAase为例,采用该策略检测HAase的检测限低至0.2 U/mL,与此同时,实现了HAase的抑制剂的检测和人尿液中HAase的准确检测。此外,还实现了作为HAase的抑制剂单宁酸的检测。这种简单和通用的方法可以克服传统的水凝胶传感器的潜在缺点,如复杂的制备步骤、响应时间慢或灵敏度低,且无需使用专门的仪器、标记分子或功能化纳米颗粒。该方法提供了一种简单、高效、高通量、低成本的检测方法,用于快速、定量检测HAase及其抑制剂,整个实验过程只需使用微小试剂量的酶,底物和检测试纸,在开发商业即时检测试剂盒方面有广阔前景。2.开发了一种集成式的基于距离的纸基生物传感器,以支链淀粉涂覆的介孔膜检测AMY体系为例,AMY能够特异性催化支链淀粉水解,破坏支链淀粉致密的缠绕结构,因此在引入AMY溶液到传感器后,会导致支链淀粉涂覆的介孔膜的渗透性发生改变,溶液自上而下渗透,并沿着检测试纸侧向流动,流动距离与AMY的浓度成正比。该传感器对于AMY的检测限低至4 mU/mL,同时可实现对AMY的抑制剂阿卡波糖和人血清中的AMY的高灵敏检测。该方法实现了一步式、无试剂化的检测目标物,对于开发用户友好、无设备和成本效益高的生物传感器具有非常好的应用前景,在疾病诊断和降糖药物筛选方面具有显著的灵敏度和良好的选择性。

关键词：刺激响应聚合物酶解比距分析即时检测纸基生物传感器

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基于变构转录因子的重金属纸基芯片检测技术研究

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作者：张永康军事科学院

学位级别：硕士

目的目前,随着工农业的快速发展,我国重金属的污染状况日益严峻。重金属污染与其他有机化合物的污染不同,它不能够在环境中降解,并且具有富集性,可以通过食物链在人体内发生蓄积,对人民群众的健康安全造成了严重的威胁。广泛存在于原核... 详细信息

目的目前,随着工农业的快速发展,我国重金属的污染状况日益严峻。重金属污染与其他有机化合物的污染不同,它不能够在环境中降解,并且具有富集性,可以通过食物链在人体内发生蓄积,对人民群众的健康安全造成了严重的威胁。广泛存在于原核生物体内负责调控小分子代谢的变构转录因子(Allosteric transcription factors,a TFs)作为新型的分子识别元件被用于生物传感器的构建。基于变构转录因子的无细胞生物传感器具有制备简单、反应快速、特异性强的优点,以变构转录因子为识别元件开发设计新的传感技术来检测水中重金属离子具有一定的实用价值。此外,纸基材料作为无细胞生物传感器的载体具有成本低、便于储存、易于携带的优势,便于现场检测的开展。本研究以水中常见的有毒重金属汞、铅、镉、砷作为研究对象,以变构转录因子为识别元件,依据变构转录因子与双链DNA的相互作用特点,结合无细胞体外转录(in vitro transcription,IVT)体系,构建了重金属无细胞合成检测技术,并且通过滚环转录(Rolling circle transcription,RCT)信号放大技术,进一步提高对于重金属检测的灵敏度。此外,设计开发包含有多个反应室的纸基芯片,以实现在现场条件下对于多种重金属离子的同时检测。本论文的主要研究内容如下:方法1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究。基于变构转录因子为分子识别元件结合表达荧光RNA的无细胞体外转录体系,设计了一种新的针对水中重金属离子的检测技术。首先构建以包含T7启动子、变构转录因子结合位点、3WJd B表达基因和T7终止子的双链DNA为反应模板的无细胞体外转录体系;而后运用表面等离子体共振实验(Surface plasmon resonance,SPR)和凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对变构转录因子进行筛选和表征;接下来向无细胞体外转录体系中加入适当浓度的变构转录因子构建无细胞合成检测技术体系;随后设计DNA逻辑电路消除信号串扰;最后通过对实际水样的检测以验证该方法的实用性。方法2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究。运用RCT的信号放大手段设计了基于变构转录因子用于水中重金属离子的超灵敏检测方法。首先设计制备了包含局部双链的单链环状DNA模板以同时满足变构转录因子的结合和RCT反应进行的需求;而后通过EMSA实验和荧光测量表征该方法检测原理的可行性;接下来进行正交实验以优化检测体系内变构转录因子的含量;最后设计DNA逻辑电路消除信号串扰。方法3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究。运用设计的微流控芯片搭载冻干的纸基生物传感器实现在现场条件下对于4种重金属的同时检测。首先通过改变变构转录因子的添加量来调整无细胞合成检测技术的检测限;随后对纸基材料及其孔径进行筛选;接下来将无细胞合成检测技术体系通过冷冻干燥的方法固定到纸基材料上构成纸基生物传感器;最后将检测不同重金属离子的检测体系放置到设计的微流控芯片上建成纸基芯片。结果1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究:在最佳条件下,通过肉眼对于荧光结果的判读即可实现对0.5 nmol/L Hg、0.1 nmol/L Pb、10 nmol/L Cd及1 nmol/L As的检出。通过DNA逻辑电路的引入成功解决了Cd检测体系中Pb的信号串扰问题。重金属离子在河水中的加标回收率为91.09-123.24%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)不大于6.71%,表明该传感技术在实际应用中的潜力。结果2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究:在最佳检测条件下,该检测方法产生的荧光值与重金属离子浓度的对数存在良好的线性关系,其线性方程分别为Hg:Y=217.5*X+534.6(R=09918),Pb:Y=161.5*X+617.7(R=09856),Cd:Y=183.8*X+463.6(R=09908),As:Y=177.3*X+549.3(R=09821),其中Y为荧光值,X为重金属离子的浓度对数,其检测限分别为0.034、0.006、0.135和0.016 nmol/L(3σ/S),与之前构建的无细胞合成检测技术相比,检测限要低2-3个数量级。结果3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究:确定了以孔径为0.2μm的醋酸纤维素膜为纸基材料,将Hg、Pb、Cd、As的检测限根据我国生活饮用水卫生标准分别调整为5 nmol/L、48 nmol/L、45 nmol/L及128 nmol/L,在现场检测的条件下实现了4种重金属离子的定性检测。结论本研究以变构转录因子为分子识别元件,分别与无细胞体外转录体系和RC

关键词：变构转录因子重金属荧光RNA 滚环转录纸基生物传感器

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