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纳米铝佐剂的制备及其辅佐HBsAg的免疫学效应研究

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纳米铝佐剂的制备及其辅佐HBsAg的免疫学效应研究

作者：何萍第三军医大学

学位级别：硕士

疫苗佐剂能够选择性的刺激免疫应答而提高免疫效果。铝盐作为疫苗佐剂已有近80年的历史。商业疫苗中的铝佐剂包括偏氢氧化铝(结晶型的AlOOH，即通常所说的氢氧化铝)和磷酸氢氧化铝(Al(OH)x(PO4)y，即通常所说的磷酸铝)。氢氧化铝佐剂由... 详细信息

疫苗佐剂能够选择性的刺激免疫应答而提高免疫效果。铝盐作为疫苗佐剂已有近80年的历史。商业疫苗中的铝佐剂包括偏氢氧化铝(结晶型的AlOOH，即通常所说的氢氧化铝)和磷酸氢氧化铝(Al(OH)x(PO4)y，即通常所说的磷酸铝)。氢氧化铝佐剂由于高吸附能力及其对某些抗原具有较好的吸附性而优于磷酸铝佐剂，它也是唯一被美国FDA认证的人用疫苗佐剂，其等电点iep(isoelectric point，iep)=11.4，在机体pH=7.4的间质液中带正电荷。虽然氢氧化铝佐剂应用历史悠久，但其具体作用机制不明，目前认为主要是“储存库效应”和“免疫刺激效应”两种机制。铝佐剂吸附抗原后，在接种区域形成抗原贮存库，一方面在该处强烈吸引树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)等抗原提呈细胞(APC)识别与内吞：另一方面，在注射局部缓慢释放抗原，延长了APC与T淋巴细胞相互作用的时间，从而提高抗体应答，增强体液免疫。氢氧化铝佐剂吸附抗原，主要依赖于抗原的物理化学特性，其他吸附条件，包括pH值、温度、胶粒粒径以及反应混合物的离子强度等，影响着氢氧化铝的吸附度。在制备过程中，这些条件常常被忽略并且很少阐明，从而影响了佐剂最佳效应的发挥。有关胶粒粒径影响其吸附能力的研究表明：相对于较大颗粒而言，较小颗粒具有更大的表面积，从而可吸附更多的抗原。例如，氢氧化铝佐剂吸附白喉内毒素的量，与其粒径成反比。我们选择HBsAg作为铝佐剂吸附的模式抗原，主要考虑如下：HBsAg是由蛋白质、糖和脂质构成的复杂的大分子聚集物，其分子量为3500kDa，脂质中的磷脂约占70％：HBsAg与氢氧化铝的吸附不是由疏水作用、电荷吸引，而主要是HBsAg的磷酸根与氢氧化铝佐剂的氢氧根，这两个配基之间的交换，提供了最强的吸附机制;并且体内与体外的吸附度变化不大，所受到的解吸附作用及其微小。所以，当氢氧化铝佐剂成为纳米级颗粒吸附HBsAg时，主要与急剧增大的比表面积有关。又由于纳米粒子具有表面反应活性高、表面活性中心多、吸附能力强等这些优异性质，从而对吸附度有较大的影响，会吸附更多的HBsAg。纳米粒子与生物体有着密切的关系，并且纳米佐剂可以避免载体效应的发生，还是巨噬细胞、树突状细胞的首选吞噬目标。正是基于纳米粒子不同于常规粒子的特性，第三军医大学硕士学位论文我们采用w/O型微乳液制备纳米铝佐剂，并初步评价了其辅佐HBsAg的疫苗佐剂的生物学行为。首先，我们考察了阳离子表面活性剂(苯扎澳钱)和助表面活性剂(正辛醇) 的最大饱和溶水量，即二者最佳复配的质量比为l:l，略大于理论值5二8，与理论值较为符合;然后讨论了最佳复配比的混合表面活性剂与油(环己烷)和Alcl3溶液形成微乳液体系的相行为，并绘制了拟三元相图，W/O型微乳液区在拟三元相图的底部。恒温下，该区域的各组分比例即为制备纳米铝佐剂的微乳液配方。在保证产品为纳米级的前提下，同时考虑生产成本，当油相一定时，溶水量越多则产量越多，在此条件下，确定适合作为制备反应相的W/0型微乳液的配方，制备了纳米铝佐剂。产物透射电镜 (TEM)照片分析:颗粒为平均粒径72.62nm的球形颗粒，形状较规则、分布均匀。X射线衍射(XRD)进一步分析，XRD图谱中峰尖的特征值主要为4.7262，4.3710，3.2019， 2.2213，1.7215，1.4577，1.3317。与JCPDS卡对照，可确定本方法制备的产品为AI(OH)3。差式量热扫描(DSc)分析的相变温度，较常规Al(O琦3颗粒的转变温度有较大的提前，主要是颗粒粒径较小的缘故，间接证明了制备产物为纳米级。为了研究纳米铝佐剂的生物学效应，我们采用未加佐剂的HBsAg为抗原，采用 ELisA狈四定了纳米铝佐剂对疫苗的吸附能力，前者上清OD45。值约为常规铝佐剂的10 倍。从免疫学观点来看，最关心的是纳米氢氧化铝佐剂能否提高其对病毒抗原的免疫应答以及对抗病毒的保护水平。我们进一步研究了纳米铝佐剂物理吸附HBsAg后的动物免疫效果。按lmg铝佐剂吸附IOpgHBsAg的标准，配制新型的乙肝疫苗。以常规铝佐剂为对照，皮下注射豚鼠，ELISA法检测血清中抗体水平以测定体液免疫应答。纳米铝佐剂在初次免疫后的第1周和第2周可以产生抗一HBs抗体，其GMT分别为22.974士1 .3612和 26.389士1.4214，而常规铝佐剂组为2士0.073和13.195士1.1204。提示:纳米铝佐剂可以较早的刺激抗一HBs抗体的产生。其机制可能是初次免疫后的爆释效应伪urst一released) 所致;但其作用时间有限，而“免疫刺激效应”是其随后的作用机制，二者在作用时间上存在着先后关系。可能正是由于该原因，纳米铝佐剂

关键词：纳米铝佐剂常规铝佐剂乙肝病毒表面抗原抗体滴度细胞免疫

合成纳米铝佐剂及其对乙型肝炎、狂犬病毒辅佐效应的研究

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免疫学杂志 2006年第1期22卷 90-93页

作者：何萍吕凤林陈月左国伟李元朝何凤慈第三军医大学西南医院胸心外科重庆400038 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室重庆400042

目的通过自制纳米铝佐剂,研究其对乙型肝炎病毒和狂犬病毒的体液免疫应答。方法在25℃条件下,采用微乳液法制备纳米铝佐剂。与常规铝佐剂比较,经皮下注射豚鼠和Balb/c小鼠后,于不同的时间测定血清中特异性IgG抗体的效价。结果透射电镜(T... 详细信息

目的通过自制纳米铝佐剂,研究其对乙型肝炎病毒和狂犬病毒的体液免疫应答。方法在25℃条件下,采用微乳液法制备纳米铝佐剂。与常规铝佐剂比较,经皮下注射豚鼠和Balb/c小鼠后,于不同的时间测定血清中特异性IgG抗体的效价。结果透射电镜(TEM)和差式量热扫描(DSC),可知产物为平均粒径约为72.62 nm,近球形的Al(OH)3结晶颗粒。纳米铝佐剂辅佐的HBsAg,在免疫Balb/c小鼠后第1周和第2周的血清抗体滴度明显高于常规铝佐剂组(P纳米铝佐剂辅佐的狂犬疫苗,其特异性IgG抗体效价高于常规铝佐剂组,并且在免疫后的第7天,抗体就呈现出阳性(P纳米铝佐剂在诱导HBsAg和Rabies疫苗体液免疫应答的早期优于目前的常规铝佐剂,能够快速地激活和提高Balb/c小鼠和豚鼠的免疫应答和应答水平。

关键词：纳米铝佐剂微乳液乙型肝炎疫苗狂犬疫苗体液免疫

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新型含铝疫苗佐剂的研究进展

中国药科大学学报 2024年

作者：任红梅熊晔蓉荀校莹姜雷涂家生中国药科大学药学院药用辅料及仿创药物研发评价中心

铝佐剂因其诱导高效持久的免疫应答作用和良好的安全性在疫苗领域被广泛应用。随着免疫学的发展，对于佐剂的要求逐渐提高，传统铝佐剂已无法满足某些应用需求。因此，为实现良好的免疫增强效果及诱导特定类型和强度的免疫反应，新型铝... 详细信息

铝佐剂因其诱导高效持久的免疫应答作用和良好的安全性在疫苗领域被广泛应用。随着免疫学的发展，对于佐剂的要求逐渐提高，传统铝佐剂已无法满足某些应用需求。因此，为实现良好的免疫增强效果及诱导特定类型和强度的免疫反应，新型铝佐剂的开发已成为研究热点。本综述介绍了铝佐剂的作用机制及安全性，并重点概述了近年来新型铝佐剂的研究进展，主要包括纳米铝佐剂和复合铝佐剂（铝佐剂与免疫刺激分子或递送载体复合），并对其未来的研究方向进行了展望，以期为铝佐剂的进一步开发和临床应用提供参考。

关键词：疫苗铝佐剂纳米铝佐剂复合铝佐剂免疫反应

铝佐剂辅佐OVA致巨噬细胞向M1型极化及其参与糖酵解的机制研究

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铝佐剂辅佐OVA致巨噬细胞向M1型极化及其参与糖酵解的机制研究

作者：黄丽婷重庆大学

学位级别：硕士

氢氧化铝佐剂是世界上第一个被FDA认证的人用疫苗佐剂,至今已有90多年,但是仍存在引起过敏反应、炎症疾病等缺点。因此,对铝佐剂予以改良一直是本领域的热点问题,其中纳米铝佐剂更是受到了诸多关注。已有的研究表明,无论是常规铝佐剂还... 详细信息

氢氧化铝佐剂是世界上第一个被FDA认证的人用疫苗佐剂,至今已有90多年,但是仍存在引起过敏反应、炎症疾病等缺点。因此,对铝佐剂予以改良一直是本领域的热点问题,其中纳米铝佐剂更是受到了诸多关注。已有的研究表明,无论是常规铝佐剂还是纳米铝佐剂,目前受到公认的作用机制主要还是储存库效应、促吞噬效应、激活NLRP3途径以及补体激活,但是这些作用机制仍然没能完全阐明。研究表明,铝佐剂对免疫应答的调控机制与巨噬细胞是密切相关的。巨噬细胞可以依据机体的不同需求向经典活化的巨噬细胞(Classically activated macrophage,M1)和替代性活化的巨噬细胞(Alternatively activated macrophage,M2)分化,分别行使促炎和抑炎的功能,在代谢水平上也有很大的差异。然而,关于铝佐剂与巨噬细胞表型的调控及能量代谢目前还缺乏系统的研究。因此,本课题聚焦巨噬细胞极化及其糖酵解水平,从巨噬细胞代谢角度分析纳米铝佐剂和常规铝佐剂提高免疫应答的作用机制,主要研究内容及结论如下:(1)铝佐剂免疫小鼠的组织学鉴定及其免疫效价检测微乳液法制备获得粒径稳定在200±50 nm,表面电荷为40±0.5 m V的纳米氢氧化铝佐剂,以此辅佐卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)免疫小鼠。HE染色结果表明纳米铝佐剂和常规铝佐剂均能引起小鼠注射部位的炎症。用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测OVA-Ig G水平,发现与常规铝佐剂相比,纳米铝佐剂在前两周能诱导更强的体液免疫应答。(2)免疫小鼠脾脏转录组测序发现差异基因功能富集在巨噬细胞上转录组测序进行差异基因功能富集,发现纳米铝佐剂组和常规铝佐剂组中都出现上下调的差异基因主要富集在巨噬细胞、中性粒细胞及小胶质细胞等免疫细胞上,其中巨噬细胞的表现最为显著。同时,在应对反应刺激、免疫过程、代谢过程等生物过程上也有突出的表现。(3)铝佐剂参与巨噬细胞表型及糖酵解水平的调控诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞,利用M1型巨噬细胞标记蛋白诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和M2型巨噬细胞标记蛋白CD206进行流式细胞术和免疫荧光,结果均表示铝佐剂可以提高M1型巨噬细胞比例,同时,纳米铝佐剂能协助OVA更快地进入巨噬细胞内部。另外,通过检测乳酸分泌量及葡萄糖摄取评估巨噬细胞糖酵解水平,酶活性检测、Western Blot检测糖酵解关键酶表达量及活性,发现铝佐剂可以通过提高己糖激酶(Hexokinases 2,HK2)、M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)、乳酸脱氢酶A(Lactate Dehydrogenase A,LDHA)蛋白表达及酶活性以增加巨噬细胞糖酵解水平。总的来说,铝佐剂可以促使巨噬细胞向M1极化并提高巨噬细胞糖酵解水平。(4)铝佐剂对巨噬细胞表型及糖酵解水平的分子调控机制依据转录组测序结果进行差异基因筛选,主要发现IRGM1、Isg15、Igtp、Irf7、Gbp4、Uba7是与巨噬细胞极化及糖酵解相关的差异基因。验证后发现,IRGM1在巨噬细胞吞噬铝佐剂后高表达。利用糖酵解抑制剂2-DG发现IRGM1处于调控糖酵解的上游。干扰IRGM1表达后,通过q PCR和Western Blot发现铝佐剂在进入巨噬细胞过程中,IRGM1通过调节巨噬细胞糖酵解限速酶HK2的表达和乳酸产生的关键酶LDHA以上调巨噬细胞糖酵解水平。以上结果说明,铝佐剂通过上调IRGM1以增强巨噬细胞糖酵解水平,驱动巨噬细胞向M1极化。综上所述,我们发现了纳米铝佐剂相较于常规铝佐剂能显著增强巨噬细胞的吞噬效应,并提出铝佐剂可以促使巨噬细胞向M1炎性表型极化,且通过IRGM1调节HK2和LDHA以促进巨噬细胞无氧糖酵解水平的增加。本研究将铝佐剂和巨噬细胞极化及糖酵解水平联系起来,从代谢水平上为铝佐剂的作用机制提供了新的见解,为铝佐剂的改良提供了新的思路。

关键词：纳米铝佐剂巨噬细胞极化糖酵解 IRGM1

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铝佐剂的吸附作用及其在疫苗中的应用

微生物学免疫学进展 2023年第2期51卷 76-81页

作者：解慧聪王婷婷刘建凯北京民海生物科技有限公司研发中心、北京市新型联合疫苗工程技术研究中心北京102600

铝佐剂(aluminum adjuvant)是人用疫苗生产中应用最广泛的一种佐剂,已使用了近百年。随着研究者对铝佐剂的研究深入,人们对铝佐剂的理化性能、吸附效果、吸附后抗原结构及稳定性变化的了解越来越全面。缓冲溶液、pH、离子强度及其他相... 详细信息

铝佐剂(aluminum adjuvant)是人用疫苗生产中应用最广泛的一种佐剂,已使用了近百年。随着研究者对铝佐剂的研究深入,人们对铝佐剂的理化性能、吸附效果、吸附后抗原结构及稳定性变化的了解越来越全面。缓冲溶液、pH、离子强度及其他相关辅料影响铝佐剂对疫苗抗原的吸附作用和吸附后抗原结构的稳定性。这些吸附条件的变化对改进疫苗制剂配方、优化疫苗生产工艺提供重要参考。同时,随着多种新型疫苗的研发,疫苗对佐剂的要求越来越高。新型纳米铝佐剂和复合佐剂因具有较高的免疫增强功能成为铝佐剂研究的新方向。现就目前常用铝佐剂的理化性能、铝佐剂对抗原的吸附作用、吸附对抗原结构稳定性的影响及新型铝佐剂的研究作一概述。

关键词：铝佐剂理化性能吸附作用抗原结构纳米铝佐剂复合佐剂

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