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多功能聚苯胺复合水凝胶在肿瘤深度治疗中的应用研究

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多功能聚苯胺复合水凝胶在肿瘤深度治疗中的应用研究

作者：胡亚琴南京邮电大学

学位级别：硕士

近些年来,基于纳米技术的药物递送系统受到了研究者们的广泛关注,然而,在治疗过程中,肿瘤组织的生理屏障常常阻碍了外来纳米颗粒向肿瘤内部的渗透,难以将抗癌药物递送到肿瘤内部,且单一药物治疗容易使肿瘤细胞产生抗药性,都极大的影响... 详细信息

近些年来,基于纳米技术的药物递送系统受到了研究者们的广泛关注,然而,在治疗过程中,肿瘤组织的生理屏障常常阻碍了外来纳米颗粒向肿瘤内部的渗透,难以将抗癌药物递送到肿瘤内部,且单一药物治疗容易使肿瘤细胞产生抗药性,都极大的影响了肿瘤治疗效果。因此,设计一种既能够提高肿瘤治疗深度又能实现协同治疗的药物递送系统具有重要意义。本论文构建新型纳米药物递送系统,采用多种策略实现药物在肿瘤区域的深度渗透,利用聚苯胺优异的光声成像性能以及光热转化性质,实现对药物渗透过程的实时追踪,同时进行光热-化疗协同治疗,最终提高了肿瘤治疗效果。具体内容包括以下三部分:(1)多功能聚苯胺-聚丙烯酸复合纳米颗粒的制备。首先通过水热法制备了聚苯胺纳米颗粒,再通过回流沉淀聚合反应制备得到多功能聚苯胺-聚丙烯酸复合纳米颗粒。在此过程中探索了不同单体比例和反应时间对合成聚苯胺-聚丙烯酸复合纳米颗粒的影响。结果表明:聚苯胺-聚丙烯酸复合纳米颗粒尺寸均一,粒径分布在245 nm左右,且材料表面带负电,可通过静电吸附作用负载带正电的抗癌药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)实现药物递送。此外,载药纳米颗粒具有优异的近红外光热升温性能和光声成像性质,为后续构建复合水凝胶药物递送系统进而实现影像指导的热疗-化疗协同治疗奠定了基础。(2)多功能复合水凝胶药物递送系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用。通过聚电解质的静电吸引相互作用制备可注射水凝胶,结合载药纳米颗粒和胶原酶构建多功能复合水凝胶药物递送系统,该药物递送系统能够实现胶原酶和载药聚苯胺复合纳米颗粒的逐级释放进而实现深度治疗。体外细胞实验表明该复合水凝胶药物递送系统具有良好的生物相容性,并可有效抑制肿瘤细胞的增值,24 h和48 h时对肿瘤细胞的抑制率分别为70.3%和77.5%。体内抗肿瘤实验显示该复合水凝胶药物递送系统对小鼠肿瘤体积抑制效果明显。(3)刺激响应型尺寸可调纳米水凝胶的构建及其在肿瘤治疗中的应用。通过回流沉淀聚合法和化学偶联制备多功能四聚苯胺-纳米水凝胶,利用静电吸附作用负载DOX构建纳米水凝胶药物递送系统。该药物递送系统具有良好的光热转化性能和光声成像性质,纳米水凝胶的温控尺寸可调也为后续的深度治疗提供了基础。小鼠的肿瘤抑制实验显示,纳米水凝胶药物递送系统具有良好的肿瘤抑制效果,有望成为深度治疗和协同治疗的可靠平台。

关键词：可注射水凝胶纳米水凝胶药物递送系统协同治疗深度治疗影像指导

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纳米水凝胶颗粒的制备和研究

纳米水凝胶颗粒的制备和研究

P(MAA-co-AM)纳米水凝胶的制备与表征

中国化学会第29届学术年会

作者：易达沈敬尧孟子晖薛敏北京理工大学化工与环境学院

在蛋白质组学中,如何识别理化性质各异、结构功能多样的蛋白质已经成为生物技术研究和产品开发的一个瓶颈。本研究根据抗原决定基原理,以组氨酸（His）标记的多肽作为目标识别物,制备一类在水相中对组氨酸标签有亲和性从而可以识别整个... 详细信息

在蛋白质组学中,如何识别理化性质各异、结构功能多样的蛋白质已经成为生物技术研究和产品开发的一个瓶颈。本研究根据抗原决定基原理,以组氨酸（His）标记的多肽作为目标识别物,制备一类在水相中对组氨酸标签有亲和性从而可以识别整个多肽的聚合物。本研究用温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）以及带电荷单体丙烯酸（Aac）、提供疏水基团的N-叔丁基丙烯酰胺（tBAm）、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）、表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）、引发剂过硫酸铵（APS）共聚制备具有温敏特性的纳米水凝胶颗粒,这类聚合物具有柔性结构,比表面积大、表面上作用位点多,可以更好地与蛋白质表面的多个位点结合。通过改变表面活性剂用量,制备得一系列不同粒径的纳米水凝胶颗粒,并通过动态光散射（DLS）测定其粒径,从而得到Aac5%与Aac20%配方表面活性剂用量与纳米水凝胶粒径大小的关系,并拟合得其关系式分别为y=67.01e-0.2284x+257.3e-6.809x+21.15 and y=147.4e-1.162x+168e-6.976x+81.7。

关键词：纳米水凝胶表面活性剂平均粒径

来源： cnki会议评论

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功能高分子学报 2018年第5期31卷 486-492页

作者：杨海鹏张幼维赵炯心东华大学材料科学与工程学院纤维材料改性国家重点实验室上海201620

利用单体对之间的氢键特殊相互作用,采用一步反应在水相中共聚甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),制备了pH响应性共聚物P(MAAco-AM)纳米水凝胶。采用纳米粒度与电位分析仪、傅里叶红外光谱仪、透射电... 详细信息

利用单体对之间的氢键特殊相互作用,采用一步反应在水相中共聚甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),制备了pH响应性共聚物P(MAAco-AM)纳米水凝胶。采用纳米粒度与电位分析仪、傅里叶红外光谱仪、透射电子显微镜、场发射扫描电镜等对P(MAA-co-AM)纳米水凝胶的尺寸、形貌、组成和结构进行了表征。系统研究了反应参数对P(MAA-co-AM)纳米水凝胶的影响。结果表明:当两单体等物质的量投料时所制备的P(MAA-co-AM)纳米水凝胶粒径分布最窄(〈Dh〉=129nm,PDI=0.095),且其粒径随着两单体用量的增加而增大。随着单体加入时间的延长或EGDMA用量的增加,P(MAA-co-AM)纳米水凝胶的粒径逐渐变小。P(MAA-co-AM)纳米水凝胶表现出极好的pH响应性:当介质的pH从4增加到8时,溶胀比高达7,体积扩张了343倍。

关键词：共聚纳米水凝胶氢键作用 pH响应性

双硒键交联的双重氧化还原响应型纳米水凝胶用于肿瘤治疗的研究

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双硒键交联的双重氧化还原响应型纳米水凝胶用于肿瘤治疗的研究

作者：王美方吉林大学

学位级别：硕士

纳米水凝胶即纳米尺度的三维结构水凝胶颗粒,它在拥有水凝胶的良好生物相容性和生物降解性的同时,还具备良好的载药性能,被广泛应用于药物递送与缓控释系统的构建。透明质酸为常用的医用材料,其作为细胞外基质重要成份的一种,对人体无... 详细信息

纳米水凝胶即纳米尺度的三维结构水凝胶颗粒,它在拥有水凝胶的良好生物相容性和生物降解性的同时,还具备良好的载药性能,被广泛应用于药物递送与缓控释系统的构建。透明质酸为常用的医用材料,其作为细胞外基质重要成份的一种,对人体无毒无害,同时为肿瘤细胞表面高表达的CD44/CD168蛋白的天然配体,并且透明质酸分子链有活泼的羧基和羟基可以和多种化合物反应,这些特点使得透明质酸成为靶向递送药物至肿瘤细胞的良好载体材料。肿瘤部位和肿瘤细胞内存在着特殊的理化环境,如微酸性,活性氧浓度高,谷胱甘肽浓度高等,经过设计的肿瘤部位特异响应型纳米载体能够使得所载带的药物在肿瘤部位定点释放,增强药物杀伤力,减少对正常细胞的损伤。双硒键有着双重氧化还原响应性,其在氧化或者还原条件下均可断开,而肿瘤细胞内的高谷胱甘肽和高活性氧含量,正是提供了这样的条件。将双硒键交联至透明质酸长链上就可以形成双重氧化还原响应型纳米水凝胶载体,其首先利用透明质酸的靶向性将药物递送至肿瘤细胞,再由于双硒键的响应性使得药物定点释放,即可达到增效减毒,可控释放的目的。本文将透明质酸与含双硒键的硒代胱胺盐酸盐通过化学交联的方法形成纳米水凝胶,以透明质酸上含有的羧基和硒代胱胺二盐酸盐上的氨基为1:1的比例制备出了含双硒键的纳米水凝胶Se-NG,结果显示其粒径均一,平均粒径为157.53±1.24nm,表面电荷为-9.6±0.18mV,形貌呈规则球形,红外图谱中在750cm呈现出Se-Se特征峰。随后用制备好的Se-NG包载铂类化疗药物奥沙利铂(OXA),形成Se-NG-OXA,其包封率为(46.58±2.54)%,载药率为(8.42±0.43)%。与含二硫键的S-NG相比,在100?M HO和5mM GSH响应条件下,Se-NG药物释放迅速且高效,是一种良好的氧化还原响应型纳米载体。在肿瘤细胞CT26的杀伤实验中,与单独的奥沙利铂药物(IC=23.34?M)相比,Se-NG-OXA(IC=15.42?M)能够增强其对于细胞的杀伤能力。同时针对奥沙利铂能够引起肿瘤免疫原性死亡这一特点,在体外进行了分子层面的研究,结果显示Se-NG-OXA能够增强结肠癌CT26细胞钙网蛋白(CRT)的暴露,促进胞内ATP与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放,增强奥沙利铂诱导的肿瘤免疫原性死亡的能力。综上所述,本文制备了一种双硒键交联的透明质酸纳米水凝胶,通过载带奥沙利铂,进行了体外抗肿瘤的研究,证明了Se-NG是一种在肿瘤治疗中具有良好应用前景的纳米载体,为肿瘤响应性纳米水凝胶的设计与应用提供了思路。

关键词：纳米水凝胶双硒键氧化还原响应免疫原性细胞死亡

SAHA的结构改造及叶酸靶向纳米水凝胶体系的抗肿瘤效果研究

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SAHA的结构改造及叶酸靶向纳米水凝胶体系的抗肿瘤效果研究

作者：郭长永河北北方学院

学位级别：硕士

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)是一类用于治疗淋巴瘤,白血病,血液病等的非实体瘤的抗癌药物,其中一种具有代表性的辛二酰胺异羟肟酸(SAHA)在2006年于美国上市,主要用于皮肤T细胞淋巴瘤治疗。但是由于SAHA临床上存在不少缺点,本文拟采... 详细信息

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)是一类用于治疗淋巴瘤,白血病,血液病等的非实体瘤的抗癌药物,其中一种具有代表性的辛二酰胺异羟肟酸(SAHA)在2006年于美国上市,主要用于皮肤T细胞淋巴瘤治疗。但是由于SAHA临床上存在不少缺点,本文拟采用结构优化的方法进行改进,于是设计合成了三种溶解性较好的SAHA的前体化合物。SAHA结构优化后发现仍存在一些缺点,如肿瘤细胞凋亡效果不理想,耐药性等。有研究表明HDACIs在肿瘤的治疗方面表现出耐药性,单一的HDACIs对肿瘤很难达到治疗的效果,于是我们想通过一种化学疗法联合HDACIs,达到对肿瘤的治疗较好的效果。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)作为一种新型微创的抗肿瘤治疗手段,尽管发展迅速,但仍存在一些不足之处,PDT治疗后改变肿瘤微环境,对肿瘤细胞生存有影响,如细胞分化、增殖、血管生成和细胞凋亡,并且光动力治疗后细胞内组蛋白乙酰化水平异常升高,有研究表明HDACIs能够降低由于光动力疗法后肿瘤中组蛋白去乙酰化酶的活性,因此联合HDACIs和PDT治疗是提高PDT疗效的必要手段。为了克服抗肿瘤药物SAHA的溶解性差,半衰短,细胞摄取量少的缺点,本文又通过一种纳米载体改善这些缺点,设计合成了具有叶酸靶向,通过酯键连接SAHA的纳米水凝胶药物传输系统。该纳米水凝胶系统具有较好的水溶性,能够逃避免疫系统的清除,并且具有长循环的特点,在肿瘤部位微酸性环境下,酯键断裂,释放抗肿瘤药物SAHA,实现抗肿瘤的作用,通过体内和体外实验对该载药体系进行评价。一、SAHA类小分子化合物的合成、表征及活性探究首先尝试用小分子活性基团改善SAHA的溶解性差的缺点,把4-氨基丁酸乙酯盐酸盐,5-氨基戊酸乙酯盐酸盐,6-氨基己酸乙酯盐酸盐通过缩合剂HATU连接在SAHA的羟基上,改善其药动力学差的缺点,核磁,质谱表征表明三个化合物的合成成功,并且用黑色素瘤细胞系对这三种化合的毒性进行测试。在双模抗肿瘤药物的合成中,先以光敏剂二氢卟吩e6为原材料,在吡啶中110℃回流得到二氢卟吩e4,在二氢卟吩e4的17位羧基通过酰胺化反应连接小分子活性基团。连接肉桂酸这个芳香类小分子化合物的活性基团,随后和新鲜饱和的盐酸羟胺反应,得到一种异羟肟酸结构的新型HDACIs小分子化合物。另外一种化合物的合成是在e4的17位接上小分子活性基团以后,进行一步碱性水解,形成羧基,通过酰胺键的缩合接上邻苯二胺,合成了一种类似于西达苯胺的HDACIs小分子化合物。通过核磁及质谱结果分析可知,我们成功合成了2个新型的双模抗肿瘤的HDACIs小分子化合物。为了解决药物的溶解性差的缺点,设想合成一种新的载体或者基团修饰来改善药物的缺点,于是本文展开了论文的第二部分的工作。二、叶酸靶向牛血清白蛋白纳米水凝胶的合成、表征及活性研究尝试把SAHA和包裹白蛋白的纳米水凝胶通过酯键连接,同时在白蛋白纳米水凝胶的表面以叶酸作为靶头,提高药物传送系统的靶向性。把难溶性药物SAHA接于纳米水凝胶表面,形成一层水化膜,利于该纳米水凝胶的稳定,有望作为一种抗肿瘤的新型载药体系。首先用NAS在牛血清白蛋白表面修饰双键,加入各种单体化合物,加入交联剂及高分子链激发剂,得到牛血清白蛋白纳米水凝胶,用缩合剂EDC/NHS把叶酸接在纳米水凝胶的表面,以N,N-羰基二咪唑(CDI)作为缩合剂接上SAHA,形成具有FA靶向作用的纳米水凝胶载药体系(FVBN)。通过红外,核磁H-NMR表征FVBN纳米载体。分别对载药纳米水凝胶与空白材料的粒径,Zeta电位,纳米水凝胶的载药量进行测定,纳米水凝胶的最大载药量为20.28%。通过透射电镜对载药纳米水凝胶和空白材料的微观结构进行观察,呈现不规则的圆球型。纳米水凝胶在PBS中和血清中的体外稳定性的考察,体外稳定考察发现载药纳米水凝胶具有良好的稳定型,48 h内粒径和PDI随时间变化较小。其次利用体外细胞毒性实验分别测定了n BSA,SAHA,FVBN对HUVEC,B16-F10,A2780的IC值。利用FITC分别对n BSA,VBN,FVBN进行修饰,修饰过后的n BSA,VBN,FVBN在激光激发下显示绿色荧光。对细胞核用DIPA进行核染,用激光共聚焦显微镜观察进入细胞荧光强度的大小。用流式细胞技术分别对n BSA,VBN,FVBN的荧光强度进行定量分析,结果显示FVBN具有较好的进入细胞的能力。利用流式细胞仪探究SAHA,VBN,FVBN对细胞的凋亡,细胞的周期阻滞效果研究。游离的SAHA,VBN,FVBN对肿瘤细胞的周期阻滞在G/G,游离SAHA的最大周期阻滞为86.33%,VBN,FVBN对肿瘤细胞的最大周期阻滞分别为89.16%,89.24%。FVBN相对于SAHA,VBN对肿瘤细胞的阻滞具有明显的优势。最后动物水平上本论文研究了FVBN的体内抗肿瘤效果,分别做了C57BL/6小鼠及裸鼠的荷

关键词： SAHA 光敏剂光动力治疗组蛋白去乙酰化酶抑制剂纳米水凝胶叶酸靶向白蛋白

功能性自组装短肽/丝素蛋白复合纳米水凝胶促进脊髓损伤后神经再生的研究

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功能性自组装短肽/丝素蛋白复合纳米水凝胶促进脊髓损伤后神经再...

作者：涂雨洁暨南大学

学位级别：硕士

目的:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）会产生抑制性微环境,例如局部炎症水平过高、神经营养因子不足、神经元匮乏,以及胶质瘢痕和空洞形成等,严重阻碍了神经再生和功能恢复。近年来,组织工程这一概念在神经修复与再生领域引起了广... 详细信息

目的:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）会产生抑制性微环境,例如局部炎症水平过高、神经营养因子不足、神经元匮乏,以及胶质瘢痕和空洞形成等,严重阻碍了神经再生和功能恢复。近年来,组织工程这一概念在神经修复与再生领域引起了广泛的关注,与传统治疗相比,利用生物材料在脊髓损伤缺损处重建神经再生微环境,可以更有效地促进神经再生和功能恢复。本课题基于功能性自组装短肽RADA16-IKVAV（F-SAP）的研究,为了改善其理化性能,将其与丝素蛋白（SF）协同组装得到复合纳米水凝胶,并将复合水凝胶长期植入体内用于SCI治疗,探究其对于轴突再生和功能恢复的影响。方法:（1）材料性能表征:将F-SAP与SF复合制备F-SAP/SF纳米水凝胶,通过多种表征手段,如流变、AFM、SEM、CD、FTIR以及Raman等对其力学性能、形貌以及二级结构进行表征,此外,我们还利用Elisa试剂盒验证了其体外生长因子缓释能力;（2）体内实验:采用椎板切除手术,对T9节段进行2 mm完全切除。处理后分为三个组:1)F-SAP/SF组;2)F-SAP组;3)SCI组（不干预）。在术后14 d取材,利用免疫荧光染色、Western Blot、Q-PCR等手段对损伤微环境炎症、轴突再生进行检测,术后60 d,通过免疫荧光染色、TEM、BDA示踪CST等技术对损伤区域髓鞘和CST再生进行检测,并利用CMEP、BBB评分对其后肢功能恢复的影响作了检测。结果:（1）与F-SAP水凝胶相比,F-SAP/SF水凝胶具有优良的力学性能和更为复杂的二级结构,组装后可以观察到更致密的微观形貌,且能更好的包覆和释放活性因子;（2）F-SAP/SF水凝胶植入能够明显减轻局部炎症反应,并提高损伤区域轴突的再生和再髓鞘化,有效促进CST跨越损伤区域再生,最终达到促进运动功能恢复的效果。结论:通过对F-SAP与SF进行复合改性,可得到一种力学性能更为优良的水凝胶,可以缓释生长因子,应用于SCI模型大鼠中,能调控局部炎症反应,改善抑制性微环境,桥接脊髓损伤断端,支持轴突再生,促进功能恢复。

关键词：组织工程自组装短肽丝素蛋白纳米水凝胶脊髓损伤神经修复

氨基酸甲酯纳米水凝胶的制备及其与蛋白、多肽相互作用的研究

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氨基酸甲酯纳米水凝胶的制备及其与蛋白、多肽相互作用的研究

作者：刘睿轩南方医科大学

学位级别：硕士

1 目的通过不同性质N-丙烯酰基-L-氨基酸甲酯功能单体制备一系列不同侧链的氨基酸甲酯纳米水凝胶,考察其与蛋白或生物标志物多肽之间的结合能力及相互作用规律,为其作为蛋白或多肽特异性识别的非生物抗体提供初步依据。2方法2.1 以疏水... 详细信息

1 目的通过不同性质N-丙烯酰基-L-氨基酸甲酯功能单体制备一系列不同侧链的氨基酸甲酯纳米水凝胶,考察其与蛋白或生物标志物多肽之间的结合能力及相互作用规律,为其作为蛋白或多肽特异性识别的非生物抗体提供初步依据。2方法2.1 以疏水性氨基酸甲酯(苯丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、酪氨酸甲酯)盐酸盐、带负电荷氨基酸甲酯(谷氨酸甲酯)盐酸盐、带正电荷氨基酸甲酯(精氨酸甲酯、组氨酸甲酯)盐酸盐、极性氨基酸甲酯(丝氨酸甲酯)盐酸盐为原料,丙烯酰氯为酰化试剂,碱性条件下制备不同性质的N-丙烯酰基-L-氨基酸甲酯。2.2 以上述N-丙烯酰基-L-氨基酸甲酯为功能单体与适量亲水性功能单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)及疏水性功能单体(TBAm)共聚,制备一系列不同侧链及不同比例的氨基酸甲酯纳米水凝胶,对其外观形状、浓度、产率、粒径、Zeta电位等性质进行表征,并考察温度、缓冲溶液及pH对其粒径的影响。2.3 通过BCA试剂盒测定法及荧光标记测定法考察氨基酸纳米水凝胶对不同分子量及等电点蛋白的结合情况,探讨其与蛋白的相互作用规律。2.4 通过荧光标记测定法考察氨基酸甲酯纳米水凝胶与小细胞肺癌生物标志物胃泌素释放肽前体(proGRP)及心衰生物标志物N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)的结合情况,探讨其与生物标志物多肽的相互作用规律。3结果3.1合成了 7种不同性质的N-丙烯酰基-L-氨基酸甲酯功能单体,核磁共振氢谱对其进行结构确证。其中N-丙烯酰基-L-谷氨酸-1-甲酯(AGlu-OMe)经检索为未见文献报道的新化合物。3.2采用上述功能单体,通过沉淀聚合法制备了一系列不同侧链及不同比例的氨基酸甲酯纳米水凝胶。对于不同侧链的氨基酸纳米水凝胶,除AGlu-OMe@NPs外,其他纳米水凝胶均具有温敏性,缓冲溶液可增强纳米水凝胶温敏性,使粒子出现聚集状态,但不同pH环境对于纳米水凝胶性质无明显影响。对于不同比例的精氨酸甲酯纳米水凝胶,增加精氨酸甲酯单体比例,纳米水凝胶温敏性随之下降,40%AArg-OMe@NPs在水中及缓冲溶液条件下几乎无温敏性。3.3纳米水凝胶与蛋白结合实验表明,对于不同分子量的人血清白蛋白、卵清蛋白及α-乳白蛋白,温敏性较强的AArg-OMe@NPs、AHis-OMe@NPs、ASer-OMe@NPs结合率较高;同时蛋白分子量越大,结合率越高;其中,AArg-OMe@NPs对三种蛋白结合率最高,分别为50.69%、32.32%、28.36%。对于不同等电点的胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶及α-乳白蛋白、肌红蛋白、溶菌酶,未见等电点与结合率的相关性。对于不同比例AArg-OMe@NPs,与10%AArg-OMe@NPs相比,20%AArg-OMe@NPs与蛋白结合率无明显变化,可能由于蛋白对纳米水凝胶侧链识别的空间位阻效应,40%AArg-OMe@NPs结合率显著下降,可能由其温敏性下降造成。3.4纳米水凝胶与生物标志物多肽的结合实验表明,对于肽链极性较强的proGRP,极性ASer-OMe@NPs结合率相对较高,达到40.66%,而对于肽链性质不显著的NT-proBNP,则未见明显的选择性。4结论具有不同侧链的氨基酸甲酯纳米水凝胶与蛋白及生物标志物多肽的结合能力不同。对于蛋白,二者相互作用与纳米水凝胶温敏性、氨基酸甲酯单体侧链的性质及蛋白的分子量有关,静电作用对于二者之间的识别作用贡献较小。对于生物标志物多肽,相互作用可能与多肽氨基酸序列中不同性质氨基酸的比例以及肽链区域性质有关。此结果为纳米水凝胶作为非生物抗体识别蛋白或生物标志物多肽提供了初步的依据。

关键词：氨基酸甲酯纳米水凝胶蛋白多肽生物标志物

pH响应的DNA纳米水凝胶用于mRNA递送与表达的研究

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pH响应的DNA纳米水凝胶用于mRNA递送与表达的研究

作者：富欣上海大学

学位级别：硕士

mRNA递送克服了转基因中感染和突变风险等问题,因此,通过递送mRNA来控制蛋白质的表达已成为当前的热点并引起了广泛的关注,成为制备疫苗和开发药物的重要新兴途径。目前尽管有一些将mRNA递送到细胞的载体,但它们在表达效率和生物相容性... 详细信息

mRNA递送克服了转基因中感染和突变风险等问题,因此,通过递送mRNA来控制蛋白质的表达已成为当前的热点并引起了广泛的关注,成为制备疫苗和开发药物的重要新兴途径。目前尽管有一些将mRNA递送到细胞的载体,但它们在表达效率和生物相容性方面是不令人满意的。因此,在本论文工作中我们研发了用于mRNA递送的DNA纳米水凝胶。纳米水凝胶除目标mRNA外全部由DNA组成,因此与那些化学合成的载体相比具有优越的生物相容性;同时,纳米水凝胶由精心设计的“X”形DNA十字架和DNA接头通过交联形成纳米球,因而促进其通过内吞作用递送到细胞中。另外,通过将pH响应性i-motif结构掺入到纳米水凝胶中,实现了mRNA在细胞内的智能释放。因此,结合有效的递送和释放,纳米水凝胶中的mRNA可以高效地翻译成相应的蛋白质,mRNA表达效率与市场化脂质体相当,但具有更好的生物相容性。该纳米水凝胶系统已分别成功递送编码高斯荧光素酶（Gluc,一种分泌蛋白）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP,一种细胞内蛋白）的mRNA。由于其出色的生物相容性和表达效率,该纳米水凝胶系统有望成为在体外和体内递送功能性mRNA的潜在选择。论文工作主要包括以下三个方面:1.pH响应性的纳米水凝胶的构建DNA纳米水凝胶系统能否被成功构建将影响其功能,因此我们首先对其组装进行了研究。该系统以DNA为基础负载mRNA,使mRNA能递送到细胞内并表达出所编码的蛋白质。该系统设计并采用具有i-motif的DNA十字架和DNA接头序列,使目标mRNA与DNA十字架交联,形成具有紧密纳米球结构的纳米水凝胶。通过电泳对DNA十字架和DNA接头的组装进行了验证,结果表明DNA十字架和DNA接头可以顺利组装。我们进一步研究了DNA十字架和DNA接头的pH响应能力,结果表明在酸性条件下,DNA十字架和DNA接头解体,而在中性或碱性条件下,DNA十字架和DNA接头可以顺利组装。2.pH响应性的纳米水凝胶负载mRNA的胞内递送将前述的纳米水凝胶递送至细胞内验证其mRNA的递送能力以及生物安全性。首先,我们根据细胞内的激光共聚焦显微镜成像系统研究了mRNA在细胞内的分布情况。接着通过流式细胞仪分析细胞对纳米水凝胶的摄取能力,以此来进一步证实纳米水凝胶运载mRNA的能力。然后,我们研究了纳米水凝胶进入细胞的途径,结果表明,纳米水凝胶主要是通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞,而少量的纳米水凝胶是通过脂筏-小泡内吞作用进入细胞。我们进一步对mRNA溶酶体逃逸机制进行了研究,结果表明,在存在抑制剂的情况下,m TORC1信号通路被抑制,mRNA的释放也被抑制。该结果与相关报道一致:位于内吞室中的转运蛋白允许mRNA通过溶酶体流出,并参与m TORC1信号通路的激活。此外,我们研究了纳米水凝胶对细胞的毒性作用,通过流式细胞凋亡实验检测对比了脂质体和纳米水凝胶对He La细胞凋亡的影响。结果表明,随着递送的mRNA量的增加,使用脂质体递送mRNA的细胞凋亡率也相应增加,而使用纳米水凝胶组的细胞凋亡率几乎没有变化。CCK-8的结果中也可以得出上述相同的结论。总体而言,这些结果突出了使用纳米水凝胶递送mRNA的安全性优势,并表明纳米水凝胶有望用于需要递送大量mRNA的领域,为后续所运载的mRNA在细胞内的表达奠定基础。3.pH响应性的纳米水凝胶负载mRNA的胞内表达我们进一步对纳米水凝胶所负载的mRNA在细胞内的表达情况进行了研究。酶活测定、RT-PCR、Western blot等分析结果表明,我们所构建的pH响应性纳米水凝胶可以将负载的mRNA成功递送到细胞内并高水平表达相应的蛋白质,表达水平与商品化脂质体相当。在递送和表达效果上,通过与非pH响应性纳米水凝胶的比较研究,我们所构建的pH响应性纳米水凝胶递送系统具有良好的释放mRNA的能力,从而使其在胞内顺利表达合成蛋白质。另外,本研究还表明,我们所构建的纳米水凝胶递送系统具有良好的普适性,对癌细胞（He La细胞）和正常细胞（L02细胞）皆适用,不同种类的mRNA（高斯荧光素酶mRNA和增强型绿色荧光蛋白mRNA）也均能表达,是一种极具潜力的mRNA递送系统。因此,我们构建的DNA纳米水凝胶系统具有将所运载的mRNA递送至细胞质中,并表达所编码蛋白质的能力,并且该递送系统具有良好的稳定性和普适性。

关键词： mRNA 纳米水凝胶 DNA 高斯荧光素酶绿色荧光蛋白

基于叶酸分子的超分子水凝胶体系的构建及其性能研究

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基于叶酸分子的超分子水凝胶体系的构建及其性能研究

作者：冯青长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:本项目从分子设计入手,用四种药物分别与叶酸分子进行基于氢键的超分子自组装从而构建稳定的超分子纳米水凝胶,研究叶酸超分子水凝胶的自组装行为、性能及结构之间的关系,一方面,可以获得稳定的超分子水凝胶生物医用材料,拓展叶酸... 详细信息

目的:本项目从分子设计入手,用四种药物分别与叶酸分子进行基于氢键的超分子自组装从而构建稳定的超分子纳米水凝胶,研究叶酸超分子水凝胶的自组装行为、性能及结构之间的关系,一方面,可以获得稳定的超分子水凝胶生物医用材料,拓展叶酸类衍生物在自组装材料方面的应用;另一方面,通过研究叶酸超分子复合物自组装机理,提出叶酸类分子发生稳定大尺度聚集的机制,完善超分子自组装理论。方法:通过叶酸-K、叶酸-L、叶酸-E、叶酸-J复合物形成凝胶时的配料比例、加热温度、加热时间等因素考察制备超分子水凝胶及其干凝胶的最佳条件,并对不同浓度、不同比例的水凝胶温度稳定性和酸碱度稳定性进行研究;使用SEM和XRD实验对制备的四类各干凝胶进行微观形貌及自组装机理研究,确定水凝胶形貌与结构之间的关系;利用IR和H NMR对二组分的键合程度进行分析,结合SEM和XRD实验数据,确定了叶酸分子与K、L、E、J四种分子自组装的机理,探究可与叶酸分子通过分子间作用力形成凝胶的化合物特征。结果:1.实验得到了配比分别为:Y:K=1:1,1:2,1:3,2:1,3:1;Y:L=1:1,1:2,1:3;Y:E=1:1,2:1,3:1;Y:J=1:1,1:2,1:3,3:1的稳定水凝胶体系,不同配比凝胶的临界凝胶浓度介于0.05-0.26mol/L之间。2.凝胶稳定性研究发现:四种凝胶体系同一摩尔比例凝胶的融变温度随着浓度增大而升高,并且浓度增大到一定程度后融变温度趋于平稳,即在一定浓度范围内,凝胶因子之间的氢键作用力随浓度的增大而增强。酸碱度对不同配比的凝胶稳定性影响则各不相同。3.超分子水凝胶形貌与结构研究表明各二组分水凝胶由于配比不同,形貌结构与分子聚集有序度也各不相同,分别形成了棒状、薄片状、花瓣状、颗粒状、片层状、球状、网状多孔等结构,通过核磁和红外光谱进一步证明其微观形貌与自组装机理的关系。4.恒温IR和变温IR的研究表明,二组分水凝胶中N-H键的伸缩振动峰与叶酸及其复合物K、L、E、J对应峰对照明显宽化,C=O峰均发生了位移,说明叶酸与K、L、E、J分子在溶剂中确实发生了基于氢键作用的自组装,且随着温度升高,氢键作用变小;利用H NMR对YJ和YE凝胶进行了检测,其结果也显示分子中的-N-H基团发生了基于氢键的超分子自组装过程。确定了以上凝胶的构成均由于叶酸分子与K、L、E、J分子发生了基于氢键的超分子自组装过程,复合物通过超分子作用力最终构建了稳定的水凝胶。结论:叶酸与苯基三嗪类衍生物(K)、三嗪类含氮杂环衍生物(L)、喋啶衍生物(J)、苄啶衍生物(E)在溶剂中均能发生基于氢键作用的自组装,形成稳定凝胶体系,为日后药物材料的发展提供了参考和理论依据。

关键词：叶酸超分子纳米水凝胶自组装