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新冠病毒N蛋白纳米抗体制备及检测卡组装

中国公共卫生 2023年第3期39卷 389-393页

作者：吴方晖阴忆烽刘艳丽雷美玲宋云扬中国国民核生化灾害防护国家重点实验室北京102205

目的通过制备新冠病毒N蛋白纳米抗体,将其应用于新冠病毒N蛋白抗原检测。方法将新冠病毒N蛋白免疫羊驼,构建N蛋白纳米抗体基因文库,通过噬菌体展示技术淘筛对新冠病毒N蛋白具有亲和力的纳米抗体,将纳米抗体基因克隆到酵母载体,挑取阳性... 详细信息

目的通过制备新冠病毒N蛋白纳米抗体,将其应用于新冠病毒N蛋白抗原检测。方法将新冠病毒N蛋白免疫羊驼,构建N蛋白纳米抗体基因文库,通过噬菌体展示技术淘筛对新冠病毒N蛋白具有亲和力的纳米抗体,将纳米抗体基因克隆到酵母载体,挑取阳性克隆菌株诱导表达,亲和层析纯化分泌蛋白,透析脱盐和浓缩后,采用ELISA法筛选对新冠病毒N蛋白高亲和性纳米抗体,交叉配对筛选出1对纳米抗体制备成胶体金免疫层析检测卡,滴加N蛋白溶液到样品孔观察检测线和质控线。结果共筛选出46株不同序列的纳米抗体,优选其中6株表达、纯化和浓缩得到纳米抗体,抗体浓度>1.0 mg/mL。ELISA筛选结果显示,6株纳米抗体均对N蛋白有高亲和力,抗体配对实验筛选到1对抗体可以夹心法检测新冠病毒N蛋白,组装成胶体金免疫层析检测卡,对新冠病毒N蛋白抗原检测可见明显检测线和质控线条带,检测限≥10μg/mL。结论制备的纳米抗体可以用于胶体金纳米抗体免疫层析检测卡,实现对新冠病毒N蛋白的检测。

关键词：新冠病毒N蛋白纳米抗体噬菌体展示交叉配对实验胶体金免疫层析

3-苯氧基苯甲酸纳米抗体免疫磁珠的制备及其鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第2期39卷 277-284页

作者：程小容史圣锐朱米何金鑫古少鹏山西农业大学动物医学学院预防兽医系公共卫生学实验室山西太谷030801

基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particle... 详细信息

基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particles,MPs)构建的免疫磁珠性能差异的研究。本研究以3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)Nb作为研究对象,通过基因工程技术在其C-端引入半胱氨酸(cysteine,Cys),获得Nb-6His-Cys重组蛋白质。利用双功能交联试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)将Nb-6His-Cys分别与BMPs和MPs进行偶联获得免疫磁珠,评价2种免疫磁珠的性能差异。结果表明,SPDP能够分别将Nb-6His-Cys定向固定在BMPs和MPs表面上;磁珠表征发现,BMP-Nb的水合粒径、电位和分散性均优于MP-Nb(BMP-Nb的水合粒径为68.43±24.54,电位-27.89 mV,分散性0.57;MP-Nb的水合粒径为27.31±5.28,电位-26.12 mV,分散性0.44);通过差值法计算发现,BMPs可展示更多的Nb-Cys(1 mg的BMPs上能够展示697±16μg 3-PBA Nb-Cys,1 mg的MPs上能够展示569±18μg 3-PBA Nb-Cys)。综上研究表明,Nb和BMPs构建的免疫磁珠性能优于Nb和MPs构建的免疫磁珠,本实验为合理选择免疫磁珠检测方法提供了理论依据,为实现3-PBA的环境快速检测提供物质支撑。

关键词： 3-苯氧基苯甲酸细菌磁颗粒化学磁颗粒纳米抗体免疫磁珠

靶向巨噬细胞的纳米抗体PET分子探针^(68)Ga-NOTA-Nb119的制备方法

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西安交通大学学报（医学版） 2022年第5期43卷 752-756页

作者：张嘉欣张明如郭玉呈庞于成王馨怡李璐瑶郑芳西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室陕西西安710061 空军医科大学西京医院核医学科陕西西安710032

目的用^(68)Ga标记纳米抗体Nb119和NbBCⅡ10,制备靶向巨噬细胞的PET探针。方法将抗Vsig4纳米抗体Nb119和同型对照抗体BCⅡ10与螯合剂NOTA共孵育,纯化后分别与^(68)Ga进行标记。通过SDS-PAGE、MALDI-TOF方法对NOTA-Nb119进行鉴定,利用Rad... 详细信息

目的用^(68)Ga标记纳米抗体Nb119和NbBCⅡ10,制备靶向巨噬细胞的PET探针。方法将抗Vsig4纳米抗体Nb119和同型对照抗体BCⅡ10与螯合剂NOTA共孵育,纯化后分别与^(68)Ga进行标记。通过SDS-PAGE、MALDI-TOF方法对NOTA-Nb119进行鉴定,利用Radio-HPLC检测^(68)Ga标记后NOTA-Nb119和NOTA-BCⅡ10放化纯度。结果SDS-PAGE结果显示,成功标记的NOTA-Nb119的泳道条带比未标记纳米抗体条带出现明显的滞后性,证明标记后产物分子量变大,纳米抗体被NOTA成功修饰。^(68)Ga能成功标记纳米抗体Nb119和BCⅡ10,经Radio-HPLC检测,^(68)Ga标记的NOTA-Nb119和NOTA-BCⅡ10放化纯度均高于90%,且可稳定存在。结论^(68)Ga标记的两种纳米抗体均具有高放化纯度和高稳定性,说明本研究可推广适用于其他纳米抗体的修饰和标记,为在PET中使用纳米抗体作为分子影像探针提供了切实可行的方法。

关键词：纳米抗体正电子发射断层扫描 NOTA ^(68)Ga标记 Radio-HPLC

前列腺特异性膜抗原(PSMA)纳米抗体基因的原核表达及天然噬菌体纳米抗体库筛选

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第11期38卷 1030-1035页

作者：张笑利陈琨江克华何洁安宇何忠明孙发贵州大学医学院生物医学系贵州贵阳550025 贵州省人民医院医学遗传科贵州贵阳550003 贵州省人民医院泌尿外科贵州贵阳550003

目的筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以PSMA为靶抗原进行三轮的淘选,采用ELISA鉴定阳性克隆,并进行测序分析,将筛选到的阳性克隆基因序列插入pET28a原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中... 详细信息

目的筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以PSMA为靶抗原进行三轮的淘选,采用ELISA鉴定阳性克隆,并进行测序分析,将筛选到的阳性克隆基因序列插入pET28a原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,利用Ni柱进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化产物。结果筛选获得4条PSMA纳米抗体序列重链可变区1(VHH1)、VHH2、VHH3、VHH4,VHH1序列未能获得明确的原核表达蛋白,VHH2、VHH3、VHH4蛋白均表达。纯化后获得了纯度高、相对分子质量(Mr)约为17000的抗PSMA纳米抗体。结论通过天然噬菌体纳米抗体库淘筛,成功获得抗PSMA的纳米抗体序列并进行了原核表达和纯化。

关键词：前列腺特异性膜抗原(PSMA) 纳米抗体噬菌体纳米抗体库原核表达

纳米抗体—多肽缀合物的合成及其募集HBV抗体生物活性研究

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纳米抗体—多肽缀合物的合成及其募集HBV抗体生物活性研究

作者：王征江南大学

学位级别：硕士

抗体募集策略是近年发展起来的一种极具潜力的新型肿瘤免疫治疗方法。该策略旨在借助抗体募集分子将体内天然存在或预免疫产生的内源性抗体募集至靶细胞表面,随后通过抗体Fc端与补体或效应细胞表面Fc受体的相互作用,激活免疫系统对靶细... 详细信息

抗体募集策略是近年发展起来的一种极具潜力的新型肿瘤免疫治疗方法。该策略旨在借助抗体募集分子将体内天然存在或预免疫产生的内源性抗体募集至靶细胞表面,随后通过抗体Fc端与补体或效应细胞表面Fc受体的相互作用,激活免疫系统对靶细胞进行杀伤。经典的抗体募集分子包含靶向结合端和抗体结合端两个功能域,分别负责识别靶细胞和募集内源性抗体。然而需要指出的是,当前可供选择的抗体主要局限在抗2,4-二硝基苯(2,4-Dinitrophenol,DNP)抗体、抗半乳糖基-α-(1,3)-半乳糖(α-Gal)抗体和抗鼠李糖(Rhamnose,Rha)抗体,但这三种抗体在人体内丰度较低且个体差异大。因此,发掘新的可用于肿瘤免疫治疗的内源性抗体,对于抗体募集策略的进一步发展和应用具有重要意义。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引发的乙型肝炎是威胁人类健康主要传染病之一。通过接种乙肝疫苗诱导机体产生高滴度的HBV抗体,可实现预防HBV感染的目的。考虑到乙肝疫苗的强制性和乙肝疫苗加强针的普及,HBV抗体已成为一种在人群中广泛存在且丰度较高的内源性抗体。基于此,我们以抗表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)纳米抗体为靶向结合端,以HBV表位肽—HBV Peptide(139-147)为抗体结合端,制备一系列纳米抗体-多肽缀合物形式的抗体募集分子,并对它们的肿瘤特异性靶向能力和HBV抗体募集能力进行验证,最后通过细胞毒试验在体外评估HBV抗体用于肿瘤免疫治疗的潜力。主要实验研究内容和结果如下:(1)纳米抗体-多肽缀合物的制备与表征。构建表达靶向EGFR的纳米抗体7D12、9G8和7D12-9G8,并固相合成获得3种含不同PEG链长的HBV表位肽衍生物。通过Sortase A酶介导的连接反应将HBV表位肽衍生物定点修饰在纳米抗体的C端,共获得9种HBV抗体募集分子。SDS-PAGE和Western Blot结果显示纳米抗体-多肽缀合物制备成功。(2)纳米抗体-多肽缀合物的肿瘤靶向能力和HBV抗体募集能力评估。流式细胞结果显示修饰HBV表位肽的纳米抗体可特异性识别并结合EGFR高表达细胞,且HBV表位肽的修饰并不会显著影响纳米抗体对肿瘤的靶向能力。免疫荧光和流式细胞术验证纳米抗体-多肽缀合物的HBV抗体募集能力,发现所有纳米抗体-多肽缀合物均能选择性地将HBV抗体锚定在EGFR高表达肿瘤细胞表面。(3)纳米抗体-多肽缀合物介导的细胞杀伤水平评估。细胞毒性实验结果显示,与对照组相比,纳米抗体-多肽缀合物可造成显著的EGFR高表达细胞死亡,证实了利用HBV抗体用于肿瘤免疫治疗的可行性。进一步的构效关系结果显示,相比未进行PEG链优化实验组,优化链长最高提升20.9%抗体募集分子介导的肿瘤杀伤活性。

关键词：肿瘤免疫疗法抗体募集分子 HBV抗体纳米抗体 Sortase A酶

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

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畜牧兽医学报 2023年第6期54卷 2509-2520页

作者：王映朱家宏赵加凯纪品品陈旭张路刘宝元孙亚妮赵钦西北农林科技大学动物医学院农业农村部国家动物疫病数据中心杨凌观测实验点杨凌712100

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是猪的一种高度传染性疾病,严重威胁全球养猪业的发展。本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)NP419L蛋白的纳米抗体并对其在ASF抗体检测中的应用进行初步评价。大肠杆菌表达和Ni-NTA亲和层... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是猪的一种高度传染性疾病,严重威胁全球养猪业的发展。本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)NP419L蛋白的纳米抗体并对其在ASF抗体检测中的应用进行初步评价。大肠杆菌表达和Ni-NTA亲和层析纯化等技术表达纯化重组NP419L蛋白;将纯化的重组蛋白免疫双峰驼,5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总RNA,经反转录、巢式PCR、酶切、连接和电转化等构建抗NP419L蛋白的噬菌体展示文库;利用噬菌体展示筛淘技术,经三轮筛淘获得抗NP419L蛋白的纳米抗体;构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白的真核表达载体,转染HEK293T细胞,ELISA和间接免疫荧光(IFA)等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与NP419L蛋白的结合;竞争ELISA初步评价获得的纳米抗体与HRP融合蛋白在ASF抗体检测中的应用。结果显示,成功制备了纯度较高的预期大小为48 ku的重组NP419L蛋白;构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6×108的噬菌体展示文库;筛淘获得了6株抗NP419L蛋白的纳米抗体;分泌表达了该6株纳米抗体与HRP的融合蛋白,ELISA检测发现该6株融合蛋白可特异性结合重组NP419L蛋白,IFA检测发现1株融合蛋白与真核表达的NP419L蛋白结合,该融合蛋白可作为探针应用于ASF抗体的检测。本研究成功筛选出6株抗ASFV NP419L蛋白的特异性纳米抗体,并对其进行了结合蛋白特性的鉴定和抗体检测初步应用的评价,为后续ASF诊断技术的研发和NP419L蛋白功能研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 NP419L蛋白纳米抗体

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FLAG标签纳米抗体的筛选、表达及验证

生物技术通报 2023年第10期39卷 323-331页

作者：王欣怡王晓倩王红军晁跃辉北京林业大学草业与草原学院北京100083 北京泰德制药股份有限公司北京100176

纳米抗体是一种新型的蛋白质工程抗体,其体积小、稳定性强、亲和力高等特性为科学研究提供了新的可能性。FLAG标签是一种广泛应用于生物学研究中的短肽标签,在生物学研究中具有重要的作用。为了制备FLAG标签的纳米抗体,利用酵母双杂交... 详细信息

纳米抗体是一种新型的蛋白质工程抗体,其体积小、稳定性强、亲和力高等特性为科学研究提供了新的可能性。FLAG标签是一种广泛应用于生物学研究中的短肽标签,在生物学研究中具有重要的作用。为了制备FLAG标签的纳米抗体,利用酵母双杂交技术筛选出具有高亲和力的纳米抗体,并对制备的FLAG纳米抗体进行性能检验。通过DNA重组技术,构建包含FLAG的诱饵载体,利用酵母双杂交技术,在驼源纳米抗体酵母文库中,筛选针对FLAG标签纳米抗体。在酵母文库中筛选出5个单一的候选抗体DNA序列,为了排除载体本身表达蛋白序列对抗体筛选带来的干扰,通过“点对点”验证方法排除非特异性杂交的可能,通过该操作确认所筛选的5株纳米抗体均能与FLAG标签发生特异性亲和反应。为了制备纳米抗体,构建了5个纳米抗体原核表达载体,并利用大肠杆菌体系进行表达。通过SDS-PAGE和Western杂交(WB)分析,结果显示,成功获得2株可溶性表达的抗FLAG标签蛋白纳米抗体。对这2株纳米抗体与商品化的常规FLAG标签抗体进行效果比对,结果显示制备的2株纳米抗体与商品化抗体均能够识别FLAG多肽及含有FLAG标签的融合蛋白,且在特异性上没有明显区别,表明制备的FLAG纳米抗体具有较好的应用前景。基于酵母双杂交技术,成功筛选并制备了FLAG标签纳米抗体,这一成果不仅丰富了纳米抗体的类型,也为抗体开发及应用提供了新的途径。该研究为进一步研究FLAG标签在生物学研究中的应用,以及纳米抗体在生物工程中的应用提供有力支持。

关键词： FLAG标签纳米抗体酵母双杂筛选表达特异性免疫沉淀

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新型冠状病毒特异性纳米抗体的筛选和鉴定

免疫学杂志 2022年第8期38卷 720-725页

作者：史震中徐晓驰吴文惠许剑锋上海海洋大学食品学院 201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海) 上海201306 启东凯默纳米生物医药有限公司

目的通过噬菌体展示技术,从骆驼外周血中筛选针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性纳米抗体,并对纳米抗体的亲和力、结合表位和中和活性进行评估。方法利用重组RBD免疫骆驼,从骆驼外周血中分离淋巴细胞,提取RNA并逆转录为cDNA,接着通过巢式... 详细信息

目的通过噬菌体展示技术,从骆驼外周血中筛选针对SARS-CoV-2 RBD结构域的特异性纳米抗体,并对纳米抗体的亲和力、结合表位和中和活性进行评估。方法利用重组RBD免疫骆驼,从骆驼外周血中分离淋巴细胞,提取RNA并逆转录为cDNA,接着通过巢式PCR扩增VHH基因,电转化至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示抗体库并进行免疫淘选,鉴定可以与RBD特异性结合的纳米抗体。分别利用Octet Red96e和HPLC测定纳米抗体与重组RBD的亲和力和结合表位,通过SARS-CoV-2假病毒中和实验测定纳米抗体的中和活性。结果从外周血淋巴细胞中成功扩增出VHH基因,构建的噬菌体展示抗体库库容为1.33×10^(8) CFU/ml;经过2轮免疫淘选,鉴定出2株特异性纳米抗体——NB2D11和NB4E9,K_(D)值分别为2.21和0.31 nmol/L;NB2D11和NB4E9具有非竞争性的结合表位,中和SARS-CoV-2假病毒的IC_(50)值分别为340.7和35.5 nmol/L。结论筛选到的2株高亲和力特异性纳米抗体可以有效地地阻断SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合,为COVID-19的诊断和治疗奠定了基础。

关键词： SARS-CoV-2 RBD 噬菌体展示技术纳米抗体

纳米抗体结构预测与金属离子(Mn2+、Mg2+)对其稳定性影响的研究

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纳米抗体结构预测与金属离子(Mn2+、Mg2+)对其稳定性影响的研究

作者：余鸿艳广西大学

学位级别：硕士

抗体是一种重要的功能蛋白,被广泛应用于疾病的预防、诊断与治疗等领域。来源于骆驼的重链单域抗体(VHH),又称为纳米抗体(Nb),具有分子量小、稳定性高、亲和力好的特征,逐渐成为全长抗体的替代选择。Nb结构包含骨架区(FRs)和互补区(CDRs... 详细信息

抗体是一种重要的功能蛋白,被广泛应用于疾病的预防、诊断与治疗等领域。来源于骆驼的重链单域抗体(VHH),又称为纳米抗体(Nb),具有分子量小、稳定性高、亲和力好的特征,逐渐成为全长抗体的替代选择。Nb结构包含骨架区(FRs)和互补区(CDRs)。目前,Nbs的CDRs结构预测仍然是一个挑战;另一方面,研究发现一些Nb结合Zn后可以提高其稳定性和与靶蛋白的亲和力,而与其它金属离子的结合情况尚不明确,有待探究。本文主要从Nbs的结构预测与金属离子对其稳定性的影响展开,以期实现Nb结构的精准预测及促进金属材料与生物材料的交叉融合。第一部分:典型Nbs的结构预测研究。按照CDR3不同长度与残基排列形成的不同抗原结合面,Nbs可以分为三个大类:凹面类(concave)、环面类(loop)与凸面类(convex)。我们从每一类中选取结构已知的代表性Nbs(Nb32、Nb80和Nb35)为对象,采用物理模型(同源模建+分子动力学模拟)和深度学习(Alpha Fold2、Rose TTAFold)两种策略对其结构特别是CDR3的预测精度进行了系统性的研究。通过比较和分析预测结果与实验结构,我们针对不同类别的Nbs给出了对其结构进行准确预测的建议,并提出Nbs与靶蛋白结合面的形成需要诱导契合的观点。第二部分:金属离子对Nb稳定性的影响研究。ICab3是一个有着独特的金属离子结合位点的抗金黄色葡萄球菌Nor C的Nb,其结合的锌离子(Zn)能够稳定ICab3且对增强ICab3抗原结合亲和力起着至关重要的作用。在本项研究中,我们将ICab3中Zn替换成其他人体中重要的金属离子包括锰离子(Mn)与镁离子(Mg),并分别使其进行100ns的分子动力学模拟,另设立无金属离子组与Zn进行对照实验,观察有无金属离子及不同金属离子对ICab3稳定性的影响。通过对模拟轨迹的构象采集分析,发现不同金属离子增强ICab3稳定性的排序为Zn>Mn>Mg。综上所述,针对三类典型纳米抗体,我们回答了如何采用分子模拟与深度学习对其结构进行预测这一问题,并通过分子动力学模拟方法中获得了纳米抗体动态的结构变化及对应的势能面,加深了对Nb结构和功能的理解;另外,我们研究了三种重要的金属离子Zn、Mn、Mg对纳米抗体ICab3的影响,为研究金属离子与Nbs的相互作用提供了基础。

关键词：纳米抗体分子动力学模拟蛋白结构预测金属离子稳定性