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温度响应的黄曲霉毒素B_(1)纳米抗体重组表达、复性及生物活性

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食品科学 2023年第18期44卷 141-148页

作者：张乐平涂追李燕萍李小江帅文苑张航何庆华南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室江西南昌330047 南昌大学食品学院江西南昌330047 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047

将不同长度类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)与纳米抗体融合表达,获得具有温度响应能力的抗黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))纳米抗体。采用递归定向连接克隆得到重组表达载体pET30a-G8-ELP20、pET30a-G8-ELP40、pET30a-G8-ELP60、pET30a-G8-ELP80,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示4种融合蛋白均以不溶性包涵体形式存在于菌体沉淀中,对其进行变性处理后,分别采用稀释复性、可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化、透析复性、柱上复性4种方式对包涵体蛋白进行复性。SDS-PAGE分析4种复性方式分别获得的4种融合蛋白,结果显示其纯度差异不显著,但ITC纯化蛋白得率最高,分别为83%、90.7%、89.5%、88.3%;间接竞争酶联免疫吸附实验测定复性后融合蛋白活性,结果表明由稀释复性法获得的G8-ELP80重组蛋白IC50最低(4.35 ng/mL);浊度分析法测得融合不同长度ELP标签纳米抗体的相变温度分别为45、38、32、28℃;圆二色谱分析显示4种融合蛋白二级结构均以β-折叠、β-转角为主,与预估结果相符。本研究将ELP标签与抗AFB1纳米抗体融合表达,实现了纳米抗体的温度刺激响应性,系统比较了不同复性方式对蛋白特性的影响,为后续AFB1检测分析提供了基础。

关键词：纳米抗体类弹性蛋白融合表达可逆相变循环包涵体复性

一株靶向沙贝病毒高度保守的S2亚基的广谱中和纳米抗体

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Science Bulletin 2023年第7期68卷 684-687页

作者：王晓云谢宇峰刘红辉雷雯雯徐柯仵丽丽范瑞文武桂珍高福王奇慧 CAS Key Laboratory of Pathogen Microbiology and Immunology Institute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China University of the Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Department of Basic Medical Sciences School of MedicineTsinghua UniversityBeijing 100084China NHC Key Laboratory of Biosafety National Institute for Viral Disease Control and PreventionChinese Center for Disease Control and Prevention(China CDC)Beijing 102206China College of Veterinary Medicine Shanxi Agricultural UniversityJinzhong 030801China

新型冠状病毒感染给人类健康和全球公共安全带来了巨大威胁,但是病毒仍在持续变异产生新的变异毒株,尤其OmicronBQ.1.1和XBB变异株,完全逃逸现有抗体药物,疫苗保护效力也严重降低。此外,多种动物源新冠相关冠状病毒(沙贝病毒)具有感染... 详细信息

新型冠状病毒感染给人类健康和全球公共安全带来了巨大威胁,但是病毒仍在持续变异产生新的变异毒株,尤其OmicronBQ.1.1和XBB变异株,完全逃逸现有抗体药物,疫苗保护效力也严重降低。此外,多种动物源新冠相关冠状病毒(沙贝病毒)具有感染人的危险。

关键词：冠状病毒感染变异毒株纳米抗体抗体药物公共安全动物源变异株病毒

微囊藻毒素纳米抗体的制备及其间接竞争酶联免疫分析方法的建立

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中国食品学报 2022年第5期22卷 332-337页

作者：司睿吴广培王锋雷红涛王弘华南农业大学食品学院广东省食品质量与安全重点实验室畜产品精准加工与安全控制技术国家地方联合工程研究中心(广东) 广州510642

微囊藻毒素(MC)作为肝毒性最强的藻毒素之一,在受污染的水体中时常检出,严重威胁着人畜饮水安全,加强其检测十分重要。在前期研究中,已成功构建抗MC-LR噬菌体展示纳米抗体文库。本研究以MC-LR-OVA作为包被原,经4轮固相淘筛,获得纳米抗体... 详细信息

微囊藻毒素(MC)作为肝毒性最强的藻毒素之一,在受污染的水体中时常检出,严重威胁着人畜饮水安全,加强其检测十分重要。在前期研究中,已成功构建抗MC-LR噬菌体展示纳米抗体文库。本研究以MC-LR-OVA作为包被原,经4轮固相淘筛,获得纳米抗体M110。该抗体可识别MC-LR,且具有良好的稳定性。基于纳米抗体M110建立了检测MC-LR的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),检测的半抑制浓度IC50值为3.55 ng/mL,检测限0.65 ng/mL,线性范围1.28~9.88 ng/mL。与UPLC-MS/MS方法检测结果相关系数达0.998,提示本方法可用于水体中微囊藻毒素残留的检测。

关键词：微囊藻毒素纳米抗体淘筛间接竞争酶联免疫分析法

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纳米抗体在肿瘤分子影像诊断中的研究进展

生命科学 2022年第1期34卷 83-90页

作者：陈曲杨晓梅施维谢深霞江梦捷孙树阳卢小玲广西医科大学口腔医学院广西纳米抗体研究重点实验室广西纳米抗体国际联合研究中心南宁530021 广西医科大学基础医学院广西纳米抗体研究重点实验室广西纳米抗体国际联合研究中心南宁530021 广西医科大学药学院药学实验中心广西纳米抗体研究重点实验室广西纳米抗体国际联合研究中心南宁530021 广西医科大学附属肿瘤医院南宁530021

肿瘤的分子影像诊断是以肿瘤关键分子作为识别靶点,借助特异性分子探针和高灵敏成像设备,在活体状态下对肿瘤进行成像的技术。在临床实践中因其具备可定性、定量、可视化的优点,近年来已经成为肿瘤早期诊断、肿瘤术前治疗的重要依据,在... 详细信息

肿瘤的分子影像诊断是以肿瘤关键分子作为识别靶点,借助特异性分子探针和高灵敏成像设备,在活体状态下对肿瘤进行成像的技术。在临床实践中因其具备可定性、定量、可视化的优点,近年来已经成为肿瘤早期诊断、肿瘤术前治疗的重要依据,在疗效监测中起到不可或缺的作用。作为可结合肿瘤特异性靶标的分子探针的重要载体,纳米抗体(nanobody,Nb)因具备体积小、稳定性强、亲和力高、免疫原性弱等显著优势,在肿瘤分子影像诊断领域中的作用日渐突出。该文就纳米抗体的结构特征、基于纳米抗体的分子探针及其在分子影像应用领域的最新进展进行综述,同时也讨论了纳米抗体应用于肿瘤成像的临床局限性,并对其未来的研究应用进行了展望。

关键词：纳米抗体单克隆抗体分子影像诊断肿瘤靶向

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纳米抗体在癌症治疗中的研究进展

生命科学 2022年第4期34卷 468-476页

作者：周慧慧陈曲杨晓梅卢小玲广西医科大学广西纳米抗体研究重点实验室南宁530021 广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心南宁530021 广西纳米抗体国际联合研究中心南宁530021 广西医科大学口腔医学院南宁530021

纳米抗体是一种单域抗体,具有体积小(~15 kDa)、稳定性好、易于加工和修饰、循环半衰期短、组织穿透性高、特异性和亲和力高等优点。因此,纳米抗体在疾病治疗研究中极具吸引力。癌症是严重危害人类健康的一类疾病,其治疗方法多种多样,... 详细信息

纳米抗体是一种单域抗体,具有体积小(~15 kDa)、稳定性好、易于加工和修饰、循环半衰期短、组织穿透性高、特异性和亲和力高等优点。因此,纳米抗体在疾病治疗研究中极具吸引力。癌症是严重危害人类健康的一类疾病,其治疗方法多种多样,其中靶向治疗逐渐成为癌症治疗的重要疗法之一。该文回顾并展望了纳米抗体结合不同技术平台在癌症靶向治疗领域的应用。

关键词：纳米抗体单域抗体癌症靶向治疗

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纳米抗体在家畜传染病防治中应用的研究进展

畜牧与兽医 2022年第2期54卷 135-140页

作者：景添陈凤强冯皓陈曦王天星赵慧英陈德坤马文涛西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

随着社会经济水平的提高,人们对动物性食品的需求量显著扩大,对其安全性的要求也越来越严格。因此,家畜疾病的科学防控就显得尤为重要。目前,我国家畜疾病尤其是传染病的防控效果并不理想,仍需要不断开发和探索新的防控产品和防控策略... 详细信息

随着社会经济水平的提高,人们对动物性食品的需求量显著扩大,对其安全性的要求也越来越严格。因此,家畜疾病的科学防控就显得尤为重要。目前,我国家畜疾病尤其是传染病的防控效果并不理想,仍需要不断开发和探索新的防控产品和防控策略。纳米抗体是最小的功能性抗原结合片段,和传统抗体相比,其具有分子量小、结构简单、稳定性高、易于基因改造、抗原特异性好、组织穿透力强等优点。纳米抗体源于骆驼科动物,作为一种新型抗体,在动物疾病防治技术中的研究和应用正逐步增加。本文重点综述纳米抗体在家畜传染病中的应用和研究进展,并结合发展趋势预测未来的研究重点。

关键词：纳米抗体家畜传染病治疗预防

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不同表达系统的治疗性纳米抗体研究进展

中国生物工程杂志 2023年第11期43卷 43-55页

作者：孙白荷吴悦赵芮楼雨馨李婉婷李延飞马琳琳上海理工大学健康科学与工程学院上海200093 上海健康医学院医学技术学院上海201318 上海市东海老年护理医院上海201303

从骆驼科动物血清中提取的纳米抗体,由于其具有不同于传统单克隆抗体的结构和较小的尺寸,以及高特异性、高理化稳定性和组织渗透性等特征,因此显示出巨大的应用潜力,被认为是生物医学发展中有前景的治疗性蛋白。利用微生物生产表达纳米... 详细信息

从骆驼科动物血清中提取的纳米抗体,由于其具有不同于传统单克隆抗体的结构和较小的尺寸,以及高特异性、高理化稳定性和组织渗透性等特征,因此显示出巨大的应用潜力,被认为是生物医学发展中有前景的治疗性蛋白。利用微生物生产表达纳米抗体无须翻译后修饰,可实现大规模生产,且显著降低生产成本。目前常规生产纳米抗体的表达系统主要为大肠杆菌、毕赤酵母和哺乳动物细胞系,此外还有真菌、植物细胞、昆虫细胞及乳酸杆菌等表达系统。详细介绍了不同表达系统的特点、优势及应用,并总结了各个系统亟须解决的问题,同时概述了治疗性纳米抗体药物的生产、研发情况及临床疾病治疗应用,以期为选择合适的表达系统,用于治疗性纳米抗体的生产及临床治疗提供参考依据。

关键词：纳米抗体异源表达抗体药物表达系统重组蛋白

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

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中国农业科学 2023年第24期56卷 4956-4966页

作者：王丹吉艳红梁世蕊杨洁朱启运中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方... 详细信息

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)，然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH)基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log10TCID50/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

关键词：新型鹅星状病毒 ORF2蛋白纳米抗体噬菌体展示技术

Anti-CXCR4纳米抗体抑制胰腺癌新生血管的机制探索

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药学学报 2022年第11期57卷 3331-3338页

作者：李雅贤徐舒怡郑玥江彭利云朱建伟吴明媛上海交通大学药学院上海200240

肿瘤新生血管为肿瘤的发生发展提供足够氧气和营养物质,支持肿瘤的生长和转移。胰腺癌微环境中基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1,又称CXCL12)及其受体C-X-C趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXC... 详细信息

肿瘤新生血管为肿瘤的发生发展提供足够氧气和营养物质,支持肿瘤的生长和转移。胰腺癌微环境中基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1,又称CXCL12)及其受体C-X-C趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)参与了肿瘤细胞的增殖、迁移和新血管生成等多个生理过程,可作为胰腺癌治疗的靶点。本研究利用大肠杆菌系统表达了靶向CXCR4分子的纳米抗体,镍柱亲和层析纯化获得anti-CXCR4纳米抗体(CXCR4 Nb)和anti-PD-L1(programmed cell death ligand 1)&CXCR4双特异性纳米抗体(PX4 BsNb),通过体外实验探究CXCR4 Nb拮抗肿瘤新生血管的作用及机制,体内验证CXCR4 Nb和PX4 BsNb对胰腺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。人外周血单个核细胞分离实验获得上海交通大学地方伦理委员会批准,动物福利和实验过程均遵循上海交通大学动物伦理委员会的规定。体外实验结果表明,0.1μmol·L^(-1)CXCR4 Nb能有效抑制SDF-1诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)迁移,拮抗胰腺星状细胞对HUVEC增殖和迁移的促进作用。在NOD/SCID小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型中,腹腔给予0.3 mg·kg^(-1)CXCR4 Nb,抑瘤率为28.8%,0.3 mg·kg^(-1)PX4BsNb抑瘤率为36.1%,且免疫荧光显示治疗组肿瘤部位血管生成均减少。CXCR4 Nb具有良好的安全性和有效性,为胰腺癌的抗血管生成治疗和纳米抗体的应用提供了理论基础。

关键词：纳米抗体基质细胞衍生因子-1 C-X-C趋化因子受体4 血管新生胰腺星状细胞胰腺癌