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基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法的建立和性能评估

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中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 818-823页

作者：孙燕燕亓德胜沈付娆杨彩月孙相美陈国宁武建伟济南德亨医学科技有限公司济南250031

目的:通过噬菌体展示技术制备抗人IgE纳米抗体,将其用于磁微粒化学发光平台建立一种猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法。方法:在WHO/IUIS过敏原数据库中检索猫致敏蛋白信息,合成序列后在原核表达系统中表达和纯化猫皮屑致敏蛋白Fel d 1... 详细信息

目的:通过噬菌体展示技术制备抗人IgE纳米抗体,将其用于磁微粒化学发光平台建立一种猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法。方法:在WHO/IUIS过敏原数据库中检索猫致敏蛋白信息,合成序列后在原核表达系统中表达和纯化猫皮屑致敏蛋白Fel d 1。使用人源IgE免疫新疆单峰驼提取淋巴细胞中的RNA建立噬菌体展示纳米抗体库,分析库容、多样性和插入率,通过筛选和鉴定获得抗人IgE纳米抗体。使用重组过敏原偶联磁微粒和吖啶酯标记纳米抗体,建立磁微粒化学法猫皮屑特异性IgE抗体检测方法。结果:噬菌体展示库的库容为1.88×108 cfu/ml,插入率为93.6%,纳米抗体纯度>95%。检测方法的线性范围为0.1~100 U/ml,与ImmunoCAP检测系统临床对比有较好的一致性。结论:成功建立了基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法,为猫过敏性疾病辅助诊断提供了技术基础。

关键词：纳米抗体过敏猫皮屑特异性IgE抗体化学发光

新型抗KPC-2型碳青霉烯酶纳米抗体的筛选与鉴定

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中国免疫学杂志 2024年第6期40卷 1259-1264页

作者：张鑫王辉许剑锋上海海洋大学食品学院农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)上海201306 启东凯默纳米生物医药有限公司启东226200

目的:产KPC-2型肺炎克雷伯菌可引起β-内酰胺类抗生素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性。通过噬菌体展示技术从抗KPC-2纳米抗体文库中筛选与KPC-2特异性结合的纳米抗体,为产KPC-2型肺炎克雷伯菌耐药性的检测和诊断提供技术支持。方法:利用... 详细信息

目的:产KPC-2型肺炎克雷伯菌可引起β-内酰胺类抗生素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性。通过噬菌体展示技术从抗KPC-2纳米抗体文库中筛选与KPC-2特异性结合的纳米抗体,为产KPC-2型肺炎克雷伯菌耐药性的检测和诊断提供技术支持。方法:利用重组KPC-2免疫双峰骆驼,从骆驼的外周血淋巴细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,通过两轮嵌套式PCR扩增出纳米抗体片段,构建抗体文库,并通过噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体。通过HPLC和OCTET分别进行表位分析和亲和力测定。结果:构建了一个库容为5.47×10^(8)cfu/ml且插入有效片段不低于81.25%的纳米抗体文库;并建立抗KPC-2纳米抗体的免疫淘选方法;获得了2个不同CDR3区的纳米抗体K2和K5,亲和力分别为6.0 nmol/L和4.8 nmol/L。且在KPC-2上具有2个非竞争性结合表位。结论:成功淘选出2个不同表位的特异性纳米抗体,有望替代传统抗体用于肺炎克雷伯菌耐药性疾病的检测和诊断。

关键词：纳米抗体噬菌体展示技术 KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌

甲氧苄啶纳米抗体噬菌体展示文库的构建及初步筛选

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中国畜牧兽医 2024年第11期51卷 5074-5085页

作者：刘翔宇尹永康张红宋茜王玲张启迪梁晓青岛农业大学动物医学院青岛266109 青岛农业大学校医院青岛266109

【目的】构建甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,制备TMP高亲和力纳米抗体,为TMP免疫分析方法的建立提供新型抗体材料。【方法】通过活性酯酶法将TMP半抗原Hapten B与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH... 详细信息

【目的】构建甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,制备TMP高亲和力纳米抗体,为TMP免疫分析方法的建立提供新型抗体材料。【方法】通过活性酯酶法将TMP半抗原Hapten B与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备2种免疫原,Hapten A和Hapten B与卵清白蛋白(OVA)偶联制备2种包被原。采用磺胺增效剂类药物单克隆抗体5C4,通过间接ELISA方法验证免疫原和包被原偶联效果。将免疫原与弗氏佐剂混合,先后对羊驼进行基础免疫和加强免疫,监测每次免疫后羊驼抗血清效价及对TMP的亲和力,选取效价及TMP亲和力最高的外周血作为纳米抗体基因来源,构建噬菌体展示文库。分离羊驼外周血总淋巴细胞,扩增重链抗体可变区纳米抗体基因(VHH),插入噬菌粒,电击转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞构建初始噬菌体纳米抗体展示文库。经辅助噬菌体救援,采用同源包被原浓度梯度递减包被、酸洗脱、TMP浓度梯度递减洗脱筛选策略筛选TMP高亲和力噬菌体并测序,原核表达纳米抗体,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纳米抗体融合蛋白。【结果】间接ELISA检测结果显示,2种免疫原与2种包被原在稀释18000倍时D 450 nm值仍高于1.25。免疫原Hapten B-BSA 5次免疫后羊驼抗血清效价为1∶88000,对TMP的半数抑制浓度(IC 50)为12.21μg/L,但Hapten B-KLH 4次免疫后羊驼抗血清效价为1∶11000,对TMP的IC 50为30.56μg/L。以Hapten B-BSA五免后羊驼外周血为纳米抗体基因来源构建噬菌体展示文库,初始库容量为6.08×10^(7) CFU/mL,目的片段插入率为96%,噬菌体展示文库多样性良好。经4轮筛选后,获得3株TMP高亲和力噬菌体,测序分析后获得1株TMP高亲和力纳米抗体及序列。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白大小约为17 ku,蛋白含量80%以上。【结论】本研究成功构建TMP纳米抗体噬菌体展示文库,获得1株TMP高亲和力纳米抗体。研究结果为磺胺增效剂类药物纳米抗体的制备提供了理论依据和技术支持,为兽药等小分子新型识别材料的制备提供了新的思路。

关键词：甲氧苄啶纳米抗体噬菌体展示文库

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基于纳米抗体识别元件的生物发光共振能量转移体系检测免疫球蛋白G

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分析试验室 2024年

作者：李小江李燕萍何庆华帅文苑曾俊杰涂追南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室南昌大学食品学院南昌大学中德联合研究院

为建立一种基于纳米抗体和生物发光共振能量转移(BRET)的均相免疫检测方法，实现免疫球蛋白G (IgG)快速定量检测，本研究以纳米荧光素酶(Nluc)为供体，以与IgG特异性结合的纳米抗体T9和蛋白L (proL) 为识别元件，构建了检测IgG的BRET传... 详细信息

为建立一种基于纳米抗体和生物发光共振能量转移(BRET)的均相免疫检测方法，实现免疫球蛋白G (IgG)快速定量检测，本研究以纳米荧光素酶(Nluc)为供体，以与IgG特异性结合的纳米抗体T9和蛋白L (proL) 为识别元件，构建了检测IgG的BRET传感器，研究了辅助结构域和不同类型受体荧光蛋白对检测体系的影响，并对传感器的IgG响应性能进行了探究。结果表明，在添加辅助结构域、受体为绿色荧光蛋白(GFP)的情况下，BRET转移效果最好，能量转移效率近0.8，而其他2种体系均约为0.6。该体系具有较好的IgG响应能力，线性范围在0.195～0.775 mg/mL之间，检测限为0.068 mg/mL。本方法可以实现IgG的快速均相检测。

关键词：免疫球蛋白G (IgG) 生物发光共振能量转移(BRET) 纳米抗体

痘苗病毒蛋白D8纳米抗体的原核表达及结合活性分析

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1728-1734页

作者：田婧婧杨晓岚李涛王慧范瑞文山西农业大学动物医学学院山西太谷030801 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有Hi... 详细信息

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有His标签和SUMO标签的抗体Anti-SUMO-D8,之后利用SUMO蛋白酶切除His标签和SUMO标签,进一步获得Anti-D8;最后,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及间接免疫荧光试验(IFA)对其结合活性进行检测并分析。结果显示,成功构建了原核表达质粒pKMD-SUMO-D8和重组菌株,在30℃条件下,终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达菌株4 h时,Anti-SUMO-D8表达量最佳;获得了高纯度的Anti-SUMO-D8和Anti-D8纳米抗体;间接ELISA结果显示,Anti-SUMO-D8和Anti-D8与抗原均具有结合活性;在相同条件下,Anti-D8与VACV及E8L的结合活性高于Anti-SUMO-D8。间接IFA结果显示,VACV侵染48 h后,试验组部分细胞核在荧光显微镜下可见绿色荧光。利用SUMO标签可高效制备VACV蛋白D8的纳米抗体,且制备的纳米抗体具有一定的结合活性。本研究结果为纳米抗体的制备提供了新思路,也为深入研究VACV蛋白D8纳米抗体的生物学功能奠定了基础。

关键词：痘苗病毒纳米抗体 SUMO 结合活性

封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ纳米抗体的制备及应用

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封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ纳米抗体的制备及应用

作者：高雪影南昌大学

学位级别：硕士

常温下,Taq DNA聚合酶Ⅰ具有一定的活性,能够引起非特异性扩增,因此极大影响了对靶标基因进行精确定量,从而限制了其在基因诊断中的应用。纳米抗体具有分子量小、易改造、高效表达、水溶性好、能与抗原结合等特点。通过免疫筛选,获得能... 详细信息

常温下,Taq DNA聚合酶Ⅰ具有一定的活性,能够引起非特异性扩增,因此极大影响了对靶标基因进行精确定量,从而限制了其在基因诊断中的应用。纳米抗体具有分子量小、易改造、高效表达、水溶性好、能与抗原结合等特点。通过免疫筛选,获得能在常温下封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ的纳米抗体,与Taq DNA聚合酶Ⅰ孵育后,制备出用于靶标基因检测的热启动PCR体系。本研究的实验结果如下:1、经原核表达和纯化后获得重组的Taq DNA聚合酶Ⅰ。经酶活分析发现,重组表达的Taq DNA聚合酶Ⅰ的相对比活力为2.1-4.2×10～4U/mg。为了能高效地筛选到封闭发挥DNA聚合活性区域的纳米抗体,经常规PCR实验鉴定,保留3’-5’外切酶区域和DNA聚合酶区域是发挥DNA聚合活性的最小区域。本研究通过表达纯化获得截短体Taq DPI-1和Taq DPI-2。2、经两轮淘选后获得10种结合DNA聚合酶结构域（T2）以及6种结合3’-5’外切酶结构域（T1）的纳米抗体。经国内某核酸检测公司的检测平台测试,发现其中四种纳米抗体（封闭T1 1个,封闭T2 3个）具有常温下降低Taq DNA聚合酶Ⅰ聚合活性的功能。为了叠加对T1和T2的封闭效果以及综合两种一价纳米抗体的特点,设计了同时结合T1和T2功能区的二价纳米抗体。构建了4种一价纳米抗体和6种二价纳米抗体的表达菌株,表达纯化获得了10种纳米抗体。3、对10种纳米抗体进行间接ELISA、热稳定性和热启动功能的检测,发现一价纳米抗体T2-49能在常温下封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ,且高温不失活;而二价纳米抗体9-1与Taq DNA聚合酶Ⅰ按1:1的摩尔比进行孵育形成复合物,常温能抑制Taq DNA聚合酶Ⅰ的活性,高温抗体变性失活,解除对Taq DNA聚合酶Ⅰ活性的抑制。将封闭后的Taq DNA聚合酶Ⅰ用于小麦来源的γ-麦胶蛋白基因的检测,结果显示,未封闭的Taq DNA聚合酶Ⅰ体系中,模板浓度log值与相应的Ct值不呈线性关系;9-1封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ的体系中,模板浓度从5×10-5ng/μL到5×10-1ng/μL范围内,log值与相应的Ct值呈良好的线性关系,与商业化抗体封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ的体系相比,标准曲线和荧光信号值基本一致,可以用于靶标基因的检测。4、为了大幅度降低封闭抗体的生产成本,本研究采用流加补料策略对重组菌进行了高密度发酵。经过34.5 h的培养,细胞的生物量OD600值达到95.2,离心收集得到菌体湿重为202 g/L。经镍层析纯化后,封闭抗体产量为216 mg/L,纯度大于90%。本研究制备的纳米抗体具有成为封闭Taq DNA聚合酶Ⅰ的商业化抗体的潜力,为其他靶标基因检测提供极具性价比的解决方案。

关键词： Taq DNA聚合酶Ⅰ 纳米抗体热启动PCR 重组表达高密度发酵

抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体的筛选、表达和鉴定

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免疫学杂志 2024年第3期40卷 309-314页

作者：蒋丹舒纬童李光琪蓝华滔黄倩莹徐广贤广东医科大学医学技术学院附属东莞第一医院东莞市分子免疫与细胞治疗重点实验室东莞523808 宁夏医科大学总医院医学实验中心银川750000

目的筛选特异性抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,表达纯化重组抗SARS-CoV-2纳米抗体,评估其特性及应用潜能。方法基于前期构建的天然噬菌体纳米抗体展示库,以生物素化SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域抗原为靶点,利用生物素-链霉亲和素... 详细信息

目的筛选特异性抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,表达纯化重组抗SARS-CoV-2纳米抗体,评估其特性及应用潜能。方法基于前期构建的天然噬菌体纳米抗体展示库,以生物素化SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域抗原为靶点,利用生物素-链霉亲和素液相筛选法、噬菌体-ELISA和测序筛选抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列;构建重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体表达载体,IPTG诱导表达并纯化,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析其特征及应用潜能。结果成功获得2条抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,并构建了相应原核表达菌;成功表达纯化重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体,其与SARS-CoV-2 S蛋白可特异性结合。结论筛选及表达的重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体为其应用于SARS-CoV-2检测和治疗及相关研究提供基础。

关键词：纳米抗体新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白纯化表达

抗PEDV纳米抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

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抗PEDV纳米抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

作者：王毅河北科技师范学院

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(PED)是一种具有高度接触性的肠道传染病,易感动物属是猪源,尤其对仔猪危害性极大。利用噬菌体展示技术简便快捷筛选出特异性抗体的技术正逐步成熟。纳米抗体可有效抑制病毒感染,可作为PEDV治疗的潜在试剂,为PEDV的治疗和... 详细信息

猪流行性腹泻(PED)是一种具有高度接触性的肠道传染病,易感动物属是猪源,尤其对仔猪危害性极大。利用噬菌体展示技术简便快捷筛选出特异性抗体的技术正逐步成熟。纳米抗体可有效抑制病毒感染,可作为PEDV治疗的潜在试剂,为PEDV的治疗和预防提供了一定的参考,也对动物源病毒抗体筛选方面有较大的理论价值和广泛的市场应用前景。本研究筛选出5株针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,取3株结合效价较高的纳米抗体进行HRP标记,并初步建立了一种双纳米抗体夹心ELISA方法,实验内容与结果如下:1.利用实验室保存的羊驼天然纳米抗体文库,通过四轮淘选-增扩-富集-测序,最终结果得到12株氨基酸序列不同的纳米抗体。首先经过原核直接诱导表达纳米抗体,经ELISA、SDS-PAGE、Western Blot鉴定,结果发现有11株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的亲和力。2.根据上述实验结果获取的11株纳米抗体序列,设计带有同源臂的上下游引物,经同源重组方法将目的序列克隆至p CAGGS-h Ig H-Fc真核载体中进行表达纯化。经IFA、Western Blot、ELISA结合实验鉴定,得到5株Nb均有良好的结合性和特异性。3.将高结合力的3株Nb进行HRP标记,以此建立双纳米抗体夹心ELISA方法,结果为Nb-1和Nb-10分别是最佳捕获抗体和最佳检测抗体,最佳捕获抗体浓度为3μg/m L,最佳检测抗体比例是1:400,S/N为4.8;最佳封闭液反应时间是5%BSA、37℃孵育反应2 h为最优;最佳抗原的孵育条件为37℃,2h;最佳检测抗体反应条件为37℃,1 h;检测抗原限度为3.125 ng/m L;根据上述最优条件,进行批间批内重复性测定变异系数分别小于5%和10%;同等条件下,选取三种腹泻重组蛋白,与PEDV-S1蛋白按相同浓度同时孵育1 h后,进行吸光值测定,结果表示特异性良好;最后采用PEDV检验此方法的临床应用效果,随着病毒样本浓度的降低,吸光值也随之变低,为检验临床样本提供了一种可行的免疫分析方法。

关键词： PEDV S1蛋白噬菌体展示技术纳米抗体双纳米抗体夹心ELISA

基于纳米抗体识别元件的生物发光共振能量转移检测体系的研究

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基于纳米抗体识别元件的生物发光共振能量转移检测体系的研究

作者：李小江南昌大学

学位级别：硕士

生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）技术是一种基于荧光素酶（光供体）和荧光团（光受体）之间的能量转移的生物物理分析技术。通过测定受体的荧光信号强度,可以定量检测分子间相互作用及其距离... 详细信息

生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）技术是一种基于荧光素酶（光供体）和荧光团（光受体）之间的能量转移的生物物理分析技术。通过测定受体的荧光信号强度,可以定量检测分子间相互作用及其距离变化。因该技术具有高灵敏度、高准确性、低成本和均相检测体系具有的操作简便等优点,因此广泛应用于分析检测中。BRET在供体与受体距离小于10 nm时才能发生,供体与受体的光学稳定性和量子产率等是影响BRET的关键因素。荧光素酶（Luciferase）常作为BRET检测体系中的发光供体,当底物存在时,可以催化底物发光。纳米荧光素酶（Nanoluciferase,Nluc）是荧光素酶家族中新发现的最小成员,因其发光性能优越、稳定性好等优点引起大家的关注。以Nluc作为发光供体的BRET,被称为NanoBRET。本研究采用纳米抗体（Nanobody,Nb）作为识别元件,以Nluc作为发光供体,绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）、超折叠绿色荧光蛋白（Superfolder Green Fluorescent Protein,sGFP）等荧光蛋白作为受体,研究Nluc与纳米抗体不同的融合形式、不同荧光蛋白以及辅助结构域SH3/Sp1对于纳米抗体识别活性、荧光蛋白的荧光性能的影响,以此为基础探索不同的供受体配对体系对能量转移效率的影响,并尝试利用纳米抗体为识别元件,建立均相免疫检测免疫球蛋白G（Immunoglobulins G,IgG）和真菌毒素的方法。主要研究内容如下:（1）IgG的BRET检测:以pET22b作为表达载体,采用基因工程技术将可特异性识别IgG可结晶片段（Fragment Crystallizable,Fc）的纳米抗体T9与Nluc进行融合,构建了发光供体的表达载体pET22-T9-Nluc;以pET25b作为表达载体,将可特异性识别IgG抗原结合片段（Fragment Of Antigen Binding,Fab）的蛋白L（Protein L,proL）与GFP进行融合,构建了光受体表达载体pET25-proL-GFP。SH3和Sp1是一对具有弱相互作用的辅助结构域,为考察其对BRET的影响,构建了pET22-T9-Nluc-SH3、pET25-proL-GFP-Sp1、pET25-proL-sGFP-Sp1。将重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达、纯化,得到可溶性重组蛋白,亲和纯化后,进行间接酶联免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）验证,结果提示IgG的结合活性大小顺序:T9-Nluc-SH3>T9-Nluc,proL-GFP>proL-GFP-Sp1>proL-sGFP-Sp1。分别进行了3组供受体配对研究:T9-Nluc与proL-GFP（第1组）、T9-Nluc-SH3与proL-GFP-Sp1（第2组）和T9-Nluc-SH3与proL-sGFP-Sp1（第3组）。当不存在IgG时第1组配对体系的BRET比率（BRET Ratio）为0.60,第2组配对体系的BRET Ratio为0.79、第3组配对体系的BRET Ratio为0.60,存在IgG时第1组配对体系的BRET Ratio为0.58,第2组配对体系的BRET Ratio为0.69、第3组配对体系的BRET Ratio为0.57,第2组的动态范围为9.73%,是第1组的3.31倍,第3组2.58倍,结果提示,第2组配对体系具备对不同浓度IgG的响应能力。（2）黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的BRET检测:Nb28AF是从噬菌体展示文库中淘选得到的抗AFB1的纳米抗体,模拟表位ME17是利用纳米抗体Nb28AF淘选获得的线性十二肽。以pET22b作为表达载体,构建了发光供体的表达载体pET22-ME17-Nluc、pET22-Nluc-ME17,以pET25b为载体构建光受体表达载体pET25-sGFP-Nb28AF,为考察辅助结构域SH3和Sp1对BRET的影响,构建了表达载体pET22-ME17-Nluc-SH3和pET25-sGFP-Nb28AF-Sp1。将重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达、纯化,得到可溶性重组蛋白,亲和纯化后使用ELISA和光谱扫描对供受体融合蛋白进行阻断活性和光谱分析,sGFP-Nb28AF、sGFP-Nb28AF-Sp1的最大半抑制浓度(Half-maximal Inhibition Concentration,IC50)分别为1.02和3.4575 ng/mL,Nluc-ME

关键词：纳米抗体生物发光共振能量转移融合表达均相免疫分析