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纳米抗体筛选技术研究进展

生物工程学报 2024年第2期40卷 350-366页

作者：唐秀兰邓安琦陈文聪赵妍王茂鹏李昌温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 温州市农产品检验测试中心浙江温州325299 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122

纳米抗体(nanobody,Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展... 详细信息

纳米抗体(nanobody,Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中,简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数,并系统介绍了应用噬菌体、酵母、细菌、核糖体/mRNA和真核细胞等表面展示系统,以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法,共8种不同体外展示技术进行快速筛选的方法及其优缺点,汇总用于提升纳米抗体功能可靠性的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台,为综合运用各种技术手段快速获得稳定、可靠、特异的纳米抗体类药物或诊断制剂提供了参考。

关键词：纳米抗体体外展示筛选亲和力成熟

基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

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中国食品学报 2024年第4期24卷 349-360页

作者：陈文星王凤华谭晓亮晏石娟张军吴绍文甘肃农业大学资源与环境学院兰州730070 猪禽种业全国重点实验室广东省农作物种质资源保存和利用重点实验室广东省农业科学院农业生物基因研究中心广州510640

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nl... 详细信息

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

关键词：黄曲霉毒素B1 纳米抗体纳米荧光素酶快速检测生物发光酶联免疫分析

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纳米抗体结构特征与制备研究进展

农业生物技术学报 2024年第1期32卷 209-219页

作者：孔静郑楠王加启赵圣国中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室

纳米抗体是仅由重链组成的具有特异性识别抗原的小分子物质，具有广泛的应用前景。本文介绍了骆驼(Camelus)体内3种不同的抗体亚型，揭示了传统抗体与纳米抗体在二硫键种类与位置、骨架区及互补决定区组成中的异同，论述了纳米抗体生产... 详细信息

纳米抗体是仅由重链组成的具有特异性识别抗原的小分子物质，具有广泛的应用前景。本文介绍了骆驼(Camelus)体内3种不同的抗体亚型，揭示了传统抗体与纳米抗体在二硫键种类与位置、骨架区及互补决定区组成中的异同，论述了纳米抗体生产简便、特异性强、稳定性高、溶解度高等特性，阐述了纳米抗体的筛选表达方法，即可以运用噬菌体展示、酵母双杂交等技术，筛选得到特异性的纳米抗体，因其结构简单，故可以在大肠杆菌(Escherichia coli)及酵母菌(Saccharomyces)等生物中进行表达，从而可以更好地研究其功能。本文为今后纳米抗体的开发和应用提供理论依据。

关键词：纳米抗体结构特征制备

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纳米抗体的研究进展及其应用现状

生物工程学报 2024年

作者：董新莹高晓薇宋浩仇华吉罗玉子中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

纳米抗体(nanobodies， Nbs)是在骆驼科动物和鲨鱼中发现的一种独特的单域抗体，即重链抗体可变区(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody， VHH)，具有很强的抗原靶向性和结合能力，规避了传统抗体体积大、稳定... 详细信息

纳米抗体(nanobodies， Nbs)是在骆驼科动物和鲨鱼中发现的一种独特的单域抗体，即重链抗体可变区(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody， VHH)，具有很强的抗原靶向性和结合能力，规避了传统抗体体积大、稳定性低、免疫原性高以及清除速度慢的缺点。Nbs与毒素、酶、放射性核苷酸、荧光基团等官能团的生物偶联，增强了Nbs的功能，使其在人与动物疾病诊断和治疗方面展现出潜在的应用价值。本文综述了Nbs的结构特性，Nbs库的构建、筛选以及亲和力成熟策略，概述了Nbs在诊断和治疗中的应用现状，以期为疫病的诊断试剂研发与临床治疗提供参考。

关键词：纳米抗体亲和力成熟免疫治疗疫病诊断

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纳米抗体及其在动物传染病防控中的应用

中国兽医学报 2024年第2期44卷 377-385页

作者：李甜甜邓效禹李智杰许丽文孙亚杰胡博白雪中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

纳米抗体是存在于骆驼科外周血中的一种天然缺失轻链的重链抗体可变区结构域,因其特殊的结构特点具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于可溶性重组表达等优点,近年来在轮状病毒、流感病毒、新型冠状病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽... 详细信息

纳米抗体是存在于骆驼科外周血中的一种天然缺失轻链的重链抗体可变区结构域,因其特殊的结构特点具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于可溶性重组表达等优点,近年来在轮状病毒、流感病毒、新型冠状病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、狂犬病病毒、金黄色葡萄球菌以及沙门菌等传染性病原体的诊断与治疗中取得了较好的应用效果。现主要介绍纳米抗体的结构与特点、制备与表达技术,在传染病诊断与治疗中的应用研究现状与发展趋势,以及优缺点,为传染病的防控技术提供参考。

关键词：纳米抗体病毒诊断治疗

基于纳米抗体建立icELISA检测乳制品中黄曲霉毒素M1

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 46-52,62页

作者：刘海媛刘颖达 Tuyatsetseg Jambal 吉日木图伊丽内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 中-蒙生物高分子应用研究联合实验室蒙古国乌兰巴托999097 蒙古国立科技大学轻工业学院蒙古国乌兰巴托999097 内蒙古中哈骆驼研究院内蒙古阿拉善737300

纳米抗体(nanobody,Nb)具有稳定性高、特异性强、易于表达等优势,已经成为小分子免疫分析的重要工具。为了监测乳制品中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的污染情况,以先前从双峰驼AFM1免疫文库中淘选得到的抗AFM1型纳米抗体M6为研究对... 详细信息

纳米抗体(nanobody,Nb)具有稳定性高、特异性强、易于表达等优势,已经成为小分子免疫分析的重要工具。为了监测乳制品中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的污染情况,以先前从双峰驼AFM1免疫文库中淘选得到的抗AFM1型纳米抗体M6为研究对象,评估其理化性质并建立间接竞争酶联免疫吸附测定法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)。优化反应体系中封闭方法、甲醇溶液、pH值和离子强度等参数后,建立竞争抑制标准曲线,并进行方法学验证特异性和准确性。结果表明,Nb-M6具有良好的亲和力和热稳定性;Nb-icELISA的检测限(limit of detection,LOD)为0.111 ng/mL,半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为1.498 ng/mL,乳制品加标回收率为89.8%~104.1%,与高效液相色谱法的检测结果趋于一致。该方法操作简单、便捷,可应用于乳制品中AFM1的初步批量筛查。

关键词：纳米抗体间接竞争酶联免疫吸附测定法黄曲霉毒素M1 乳制品

靶向白细胞介素1β纳米抗体的制备及其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响

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中华医学杂志 2024年第22期104卷 2066-2073页

作者：欧阳情王露 Nasser Moussa Ide 邓刚张新奎游婷苏浩滔朱平华南理工大学医学院广州广东省心血管病研究所南方医科大学附属广东省人民医院(广东省医学科学院)广东省心脏病发病机制与精准防治重点实验室广州市心脏发病机制与重点防治重点实验室广州

目的制备抗白细胞介素1β(IL-1β)纳米抗体, 并观察其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法利用DNA重组技术, 使用pET-16b和pHEN1表达载体构建抗IL-1β纳米抗体的重组质粒(pET-16b-4G6M-VHH、pET-16b-5BVP-VHH、pET-16b-5MVZ-VHH和pHEN1-... 详细信息

目的制备抗白细胞介素1β(IL-1β)纳米抗体, 并观察其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法利用DNA重组技术, 使用pET-16b和pHEN1表达载体构建抗IL-1β纳米抗体的重组质粒(pET-16b-4G6M-VHH、pET-16b-5BVP-VHH、pET-16b-5MVZ-VHH和pHEN1-4G6M-VHH、pHEN1-5BVP-VHH、pHEN1-5MVZ-VHH, 其中VHH为重链单域抗体, 4G6M-VHH、5BVP-VHH、5MVZ-VHH分别为3种抗IL-1β的纳米抗体), 将构建成功的质粒分别转入大肠杆菌Rosetta2(DE3)表达菌中进行诱导表达及镍柱纯化, 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹对表达产物及纯化产物进行鉴定, 并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其亲和力。将纯化所得亲和力最高的抗IL-1β纳米抗体(pHEN1-5MVZ-VHH)应用于小鼠HL-1心肌细胞缺氧模型(分为正常对照组、缺氧模型组、空白质粒组及12.5、25.0、50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组), 并检测细胞存活率及凋亡率。结果 SDS-PAGE和Western印迹结果显示, 成功得到相对分子质量约15 000的抗IL-1β纳米抗体;ELISA结果显示, 与pET-16b载体组相比, pHEN1载体组所表达的纳米抗体与IL-1β抗原的亲和力更高(4G6M-VHH组:3.20±0.03比1.20±0.03, P纳米抗体, 且pHEN1载体表达的纳米抗体具有更好的抗原亲和作用。此外, pHEN1-5MVZ-VHH治疗可减少缺氧小鼠心肌细胞凋亡。

关键词：缺氧心肌细胞细胞凋亡白细胞介素1β 纳米抗体原核表达

抗癌胚抗原(CEA)纳米抗体的筛选鉴定及双纳米抗体夹心ELISA检测CEA

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中国生物工程杂志 2024年第2期44卷 48-58页

作者：王新婷胡倩倩娄楚杨天宁李江伟新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046

目的:筛选能与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)高亲和力结合的纳米抗体(nanobodies,Nbs),用于今后开发CEA的快速检测方法。方法:使用人CEA蛋白免疫双峰驼,以淋巴细胞cDNA为模板,采用巢式PCR扩增重链抗体可变区(VHH)基因,连接到p... 详细信息

目的:筛选能与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)高亲和力结合的纳米抗体(nanobodies,Nbs),用于今后开发CEA的快速检测方法。方法:使用人CEA蛋白免疫双峰驼,以淋巴细胞cDNA为模板,采用巢式PCR扩增重链抗体可变区(VHH)基因,连接到pMECS载体,电转化TG1大肠杆菌,构建VHH cDNA文库。经辅助噬菌体M13K07感染后生成噬菌体展示文库,采用ELISA固相亲和淘洗方法,富集与CEA结合的VHH克隆,通过胞间质可溶性ELISA(PE-ELISA)筛选与CEA高结合的纳米抗体,并在WK6中进行IPTG诱导表达和亲和纯化。ELISA检测纳米抗体与CEA的结合特异性,竞争ELISA筛选配对纳米抗体构建夹心ELISA。结果:构建获得了库容为2.8×10^(8) cfu的VHH文库,菌液PCR表明VHH插入约为100%,随机挑取第2~3轮淘洗富集的90个克隆进行PE-ELISA检测,结果45个克隆为阳性,序列分析表明,它们编码7个纳米抗体序列。在WK6中,这些纳米抗体以可溶形式表达,经Ni亲和层析获得了纯度接近90%的重组纳米抗体。间接ELISA显示7株纳米抗体均特异结合CEA,其中2株纳米抗体3G2和3F4与CEA具有较高亲和力且呈浓度依赖,即使在高浓度(5μg/mL)下也不与无关蛋白溶菌酶结合,表现出较高特异性。竞争ELISA结果显示,3G2和3F4在结合CEA中没有竞争作用,表明3G2和3F4结合在CEA的不同表位。将3F4作为捕获抗体,3G2作为检测抗体,建立了双纳米抗体夹心ELISA方法(2Nbs-ELISA法),其对溶液中CEA的检测限(limit of detection,LOD)为1.8 ng/mL。结论:采用获得的两株CEA特异纳米抗体建立了夹心ELISA检测方法,对CEA的检测具有更高敏感性和特异性。

关键词： CEA 纳米抗体噬菌体展示表位归类双纳米抗体夹心ELISA

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抗IL-5纳米抗体筛选及活性检测

中国生物工程杂志 2024年第2期44卷 59-68页

作者：李诗洁代维燕王雪莲刘畅梁耀极白仲虎陈永奇江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室无锡214122 珠海瑞思普利医药科技有限公司珠海519040

白介素-5(IL-5)是一种同源二聚体细胞因子,是嗜酸性粒细胞(eosinophilic,EOS)增殖、活化和成熟的重要调节因子。抗IL-5单克隆抗体能阻断IL-5与IL-5受体亚单位α(IL-5Rα)结合,已成功用于治疗嗜酸性粒细胞哮喘。目前上市的单克隆抗体药... 详细信息

白介素-5(IL-5)是一种同源二聚体细胞因子,是嗜酸性粒细胞(eosinophilic,EOS)增殖、活化和成熟的重要调节因子。抗IL-5单克隆抗体能阻断IL-5与IL-5受体亚单位α(IL-5Rα)结合,已成功用于治疗嗜酸性粒细胞哮喘。目前上市的单克隆抗体药物需要反复注射给药,严重影响了患者的依从性,而且注射给药的全身暴露率高。为获得适合吸入给药的抗体,在羊驼天然库中通过3轮淘选,挑取单克隆通过Phage ELISA初筛,共获得461个阳性克隆,其中50个为序列独特的分子,最终选择30个分子进行重组表达纯化。通过ELISA结合、ELISA阻断、FACS阻断、TF-1增殖抑制等实验对候选抗体进行体外活性检测,成功获得一个具有阻断IL-5和IL-5Rα结合的纳米抗体AIL-A96-Fc。通过与人和猴IL-5的ELISA结合实验表明,该分子具有良好人猴交叉活性,而且在FACS阻断实验和ELISA阻断实验中,AIL-A96-Fc表现出良好的阻断效果。该开发方法不仅提供了一个靶向IL-5的候选纳米抗体AIL-A96-Fc,也为后续开发更多靶向IL-5的候选纳米抗体提供了指导意义。

关键词：白介素-5 纳米抗体阻断活性噬菌体展示哮喘