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ATP敏感性钾通道SUR2B/Kir6.1亚型选择性开放剂纳他卡林的心血管药理学作用特征

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中国药理学通报 2009年第2期25卷 164-168页

作者：唐渊王汝欢潘志远崔文玉汪海军事医学科学院毒物药物研究所北京100850 北京赛德维康医药研究院北京100039 军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津300050

目的研究SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道开放剂纳他卡林的心血管药理学作用。方法(1)血流动力学测定:戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,从颈总动脉插管至左心室,连接八导生理记录仪记录心功能的变化。(2)制备大鼠离体工作心脏,观察纳他卡林对其心... 详细信息

目的研究SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道开放剂纳他卡林的心血管药理学作用。方法(1)血流动力学测定:戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,从颈总动脉插管至左心室,连接八导生理记录仪记录心功能的变化。(2)制备大鼠离体工作心脏,观察纳他卡林对其心功能的影响。(3)制备大鼠尾动脉血管条,用去甲肾上腺素预收缩后,观察累积给予纳他卡林对血管张力的影响。结果纳他卡林10-8～10-4mol.L-1对大鼠离体工作心脏功能无影响;对大鼠尾动脉血管条具有内皮细胞依赖性舒张作用。麻醉大鼠,纳他卡林0.5、2、***-1静脉注射可剂量依赖性降低血压,纳他卡林***-1抑制心脏的收缩和舒张功能,其效应可被格列苯脲和L-NAME拮抗。结论纳他卡林对心脏无直接作用,可通过舒张血管降低血压;纳他卡林的心血管药理学作用与其选择性开放KATP通道、促进内皮细胞释放NO有关。

关键词：纳他卡林 K_ATP通道 SUR2B/Kir6.1通道内皮细胞心血管作用

SUR2B/Kir6.1通道开放剂纳他卡林对低氧致大鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用

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中国应用生理学杂志 2012年第3期28卷 241-244页

作者：卫华曹燕卿张竞丹彭哲杨丹凤刘嘉瀛石永平杨永林汪海军事医学科学院卫生学环境医学研究所全军军事环境医学重点实验室天津300050 北京赛德维康医药研究院北京100850

目的:探讨纳他卡林对低氧引起大鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法:选取大鼠主动脉内皮细胞作为体外低氧损伤的细胞模型,分为正常对照组、低氧模型组、纳他卡林低、中、高剂量组,利用MTT法测定细胞生存率,硝酸还原酶法检测... 详细信息

目的:探讨纳他卡林对低氧引起大鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法:选取大鼠主动脉内皮细胞作为体外低氧损伤的细胞模型,分为正常对照组、低氧模型组、纳他卡林低、中、高剂量组,利用MTT法测定细胞生存率,硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)释放,RT-PCR法检测细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平。结果:纳他卡林三个剂量组均可逆转低氧所致的血管内皮细胞功能改变,包括提高内皮细胞生存活力和NO的释放水平,显著抑制低氧引发的内皮细胞ICAM-1,ET-1,VEGF mRNA表达量的上调。结论:纳他卡林对低氧诱发的血管内皮细胞分泌功能改变、细胞通透性增加及炎性因子的分泌均具有保护作用。

关键词：纳他卡林低氧大鼠主动脉内皮细胞血管活性物质

埃他卡林和纳他卡林对心肌的保护作用及其药理学机制的研究

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埃他卡林和纳他卡林对心肌的保护作用及其药理学机制的研究

作者：李琳中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

心血管疾病(CVD)致死人数大概占每年全球死亡人数的20%[1]。有专家称,目前我国正处于心血管疾病暴发的“窗口期”,如果不采取及时有效的干预行动,心血管病将在中国未来的10年内大流行。目前,治疗冠心病的药物主要以抗心肌缺血药物为主,... 详细信息

心血管疾病(CVD)致死人数大概占每年全球死亡人数的20%[1]。有专家称,目前我国正处于心血管疾病暴发的“窗口期”,如果不采取及时有效的干预行动,心血管病将在中国未来的10年内大流行。目前,治疗冠心病的药物主要以抗心肌缺血药物为主,但其心脏保护的作用效果有时并不十分理想,并常伴有各种各样的副作用,因此,研制出疗效好,针对性强,副作用少的新型治疗药物成为抗心肌缺血药物研究的重中之重。早期研究显示,ATP敏感性钾通道(K)是心肌抗缺血缺氧的重要靶点[2-5]。但不仅不同组织的K所发挥的功能不同,其分子结构、生理学特性、病理生理和药理学特性也存在组织差异。因此,K开放剂(KCOs)也由于分别作用于不同的亚基,而会产生不同的药理学作用。虽然许多研究者认为K开放剂通过减少坏死、促进缺血后心肌功能恢复、抑制心肌挛缩并减少ATP水解来起到心肌保护作用,但是其具体的作用机制仍未被完全阐明。不过,随着近几年相关研究突飞猛进的发展,线粒体在心脏保护作用中所起的作用引起了人们的关注与重视,线粒体K(mitoK)已经成为心肌保护作用的新靶标。埃他卡林(iptakalim, Ipt)是一个脂肪胺类新结构类型的ATP敏感性钾通道开放剂,本实验室早期研究证明:它是细胞膜K开放剂,其抗高血压作用和心血管活性均可被K拮抗剂格列本脲所对抗[6],可与K开放剂结合位点特异性结合[7];表明埃他卡林的保护作用与膜K激活有关。而埃他卡林对于K具有较高的亚型选择性:它对SUR1/Kir6.2无激活作用,对SUR2A/Kir6.2的作用弱,对SUR2B/Kir6.1的激活作用强,比对SUR2A/Kir6.2的作用强10倍,亚型选择性高[8-11]。另有研究表明,埃他卡林可拮抗H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤作用,该保护作用可能与线粒体ATP敏感性钾通道相关[12]。但是目前,埃他卡林是否对心肌细胞氧化应激损伤有保护作用尚无报道,其作用机制也不明确。纳他卡林(natakalim, Nat)是埃他卡林的新衍生物,与埃他卡林有所不同的是,其具有选择性激动SUR2B/Kir6.1的作用[13-17],但其对于心肌细胞的作用机制也尚不明确。因此,为进一步探讨两种药物可能的作用机理,本实验应用二氮嗪为阳性对照药物,以H2O2在乳鼠原代心肌细胞上模拟建立心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞氧化应激损伤模型,观察两种药物的干预作用;并通过测定心肌线粒体的呼吸功能及基质容积变化,明确两种药物的药理学特征,为寻找到组织选择性强、毒副作用小、保护作用明确的新型抗缺血药物提供理论依据。研究结果: 一、埃他卡林和纳他卡林对乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用埃他卡林和纳他卡林对细胞的保护作用可以有效地降低细胞膜的通透性,减少乳酸脱氢酶的外漏;提高超氧化物歧化酶的活性,有效提高细胞自身的抗氧化应激的能力;由此,可以有效地起到细胞的保护作用,提高损伤后细胞的存活率。并且,两种药物的这种细胞保护作用可被线粒体K通道阻断剂5-羟基癸酸酯所拮抗,也可被K通道阻断剂格列本脲阻断。提示,埃他卡林的作用途径可能是通过细胞膜K通道与线粒体膜K通道共同作用产生的。二、埃他卡林和纳他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响 1、埃他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响 ①埃他卡林对NADH氧化呼吸链的R4、R3和RCR均没有显著的影响,但是能够提升大鼠心肌线粒体的P/O比值,说明埃他卡林能够减少生成固定数量ATP时所消耗的氧原子;②而对于琥珀酸氧化呼吸链,埃他卡林可以加快其R4呼吸速率从而降低其RCR,说明埃他卡林可以导致琥珀酸氧化呼吸链的轻度解偶联效应。二氮嗪也可以起到与埃他卡林相似的作用,但是埃他卡林在降低RCR方面的效果要略优于二氮嗪(P他卡林对线粒体FAD呼吸链的作用:5-HD存在时,R4下降,RCR升高,P/O比回落。结果说明埃他卡林对线粒体琥珀酸氧化呼吸链的作用是通过开放mitoK通道引起的;③埃他卡林可以降低线粒体悬液在540nm处的吸光值,5-HD可以拮抗这种作用,其结果从另一侧面证实了埃他卡林是通过开放mitoK通道起作用的。二氮嗪也可以降低其吸光值,并且其作用也可以被5-HD所阻断,验证了二氮嗪是线粒体ATP敏感性钾通道开放剂。 2、纳他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响 ①纳他卡林与埃他卡林的作用稍有不同,其对于NADH氧化呼吸链的R3没有显著的影响,但可升高R4从而引起RCR降低。对于大鼠心肌线粒体的P/O比值也没有显著影响,说明纳他卡林对心肌线粒体NADH呼吸链能够起到轻微的解偶联作用,且5-HD可以阻断这种作用;②对于FAD氧化呼吸链,纳他卡林可以加快其R4呼吸速率从而降低RCR,说明纳他卡林可以导致琥珀酸氧化呼吸链的轻度解偶联效应

关键词：心肌细胞氧化应激损伤心肌线粒体呼吸功能线粒体ATP-敏感性钾通道埃他卡林纳他卡林

纳他卡林对鼠脑线粒体ATP敏感性钾通道的开放作用

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中华老年多器官疾病杂志 2011年第3期10卷 256-260页

作者：赵刚龙超良汪海中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所北京100850 北京赛德维康医药研究院北京100039

目的探讨纳他卡林对脑线粒体ATP敏感性钾通道的影响。方法急性分离大鼠脑线粒体,采用Clark氧电极法测定纳他卡林对线粒体耗氧速率的影响;采用紫外分光光度法测定纳他卡林对线粒体悬液在540 nm处的吸光值的影响,用以监测线粒体基质容积... 详细信息

目的探讨纳他卡林对脑线粒体ATP敏感性钾通道的影响。方法急性分离大鼠脑线粒体,采用Clark氧电极法测定纳他卡林对线粒体耗氧速率的影响;采用紫外分光光度法测定纳他卡林对线粒体悬液在540 nm处的吸光值的影响,用以监测线粒体基质容积的变化。结果纳他卡林可使脑线粒体的耗氧速率增加(7.58±2.76)%(P纳他卡林可使脑线粒体悬液在540 nm处的吸光值显著减小(P纳他卡林可开放脑线粒体ATP敏感性钾通道。

关键词：脑线粒体纳他卡林线粒体ATP敏感性钾通道

纳他卡林改善异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭的作用及其内皮细胞机制

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纳他卡林改善异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭的作用及其内皮细胞机制

作者：钟明利广西医科大学

学位级别：硕士

心力衰竭是由于心脏长期负荷过重、心肌损害及收缩力减弱所致的心功能不全的一种复杂的综合症,.是众多心血管疾病的严重或终末阶段。目前,临床上用于治疗心力衰竭的药物疗效并不理想,作用靶点主要集中在心脏和血管平滑肌上,均具有各自... 详细信息

心力衰竭是由于心脏长期负荷过重、心肌损害及收缩力减弱所致的心功能不全的一种复杂的综合症,.是众多心血管疾病的严重或终末阶段。目前,临床上用于治疗心力衰竭的药物疗效并不理想,作用靶点主要集中在心脏和血管平滑肌上,均具有各自的局限性。因此在心脏和血管平滑肌以外寻找新的抗心衰作用靶点以及相应的新型抗心衰药物具有重要意义。而激活内皮细胞ATP敏感性钾通道（KATP）是治疗心血管疾病的重要策略,纳他卡林（natakalim, Nat）是一种新型的SUR2B/Kir6.1亚型KATP开放剂,能通过纠正内皮功能紊乱改善压力超负荷所致的心脏重构和心力衰竭,但其机制尚未阐明,需进一步研究。本文意在异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO）所诱导的大鼠心力衰竭模型上研究Nat的保护作用及其可能的内皮细胞机制。方法：实验所用动物为健康雄性Wistar大鼠（180～220克）,将大鼠随机分为6组（n=10～12）：正常对照组,模型组,纳他卡林（1,3,9mg/kg/d）组和埃他卡林（3mg/kg/d）组;模型组和给药治疗组均连续7天皮下注射ISO（85mg/kg/d）,正常组注射等量的0.9%生理盐水;并同时开始连续灌胃给药6周,正常组和模型组给予等量的生理盐水。纳他卡林和埃他卡林溶于0.9%生理盐水,给药容积为2ml/kg。第一部分：纳他卡林对异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭的防治作用及其特征各组大鼠连续灌胃给药6周后,使用八导生理记录仪测定血流动力学参数和心脏功能的变化;称量计算各心脏指数;HE染色和Masson’s染色观察心肌组织病理学改变;ELISA法测定心肌组织羟脯氨酸的含量;提取心肌组织总RNA, Real-time PCR法检测心力衰竭的标志物——心房利钠肽（atrial natriuretic peptide, ANP）和脑钠肽（brain natriureticpeptide, BNP）基因的表达。第二部分：纳他卡林改善异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭的内皮机制在给药完第6周,测定血流动力学参数之后,收集血样并将动物通过放血处死,生化法检测血清中NO含量;放射免疫法检测血浆中PGI2、ET-1含量;免疫组化法测定心肌组织中内皮素受体A （ETAR）和内皮素受体B（ETBR）的表达;提取心肌组织的总蛋白,采用Western blot法测定心肌组织中eNOS和iNOS蛋白的表达。结果：第一部分：纳他卡林对异丙肾上腺素致大鼠心力衰竭的防治作用及其特征血压：大鼠在造模的同时连续灌胃给药6周后,使用八导生理记录仪测定血压和血流动力学参数,结果与正常对照组相比,模型组的收缩压和舒张压都显著降低,经过Nat1,3,9mg/kg/d和Ipt3mg/kg治疗6wk后,各组大鼠股动脉SBP, DBP, MBP显著恢复（P＜0.05,P＜0.01）。心功能：与正常对照组相比,反映大鼠心脏收缩功能的指标左室收缩压（left ventricular systolic pressure, LVSP）,左室压力最大上升速率（+dp/dtmax）、心肌纤维缩短速度的生理最大值（Vmp）,心肌纤维缩短速度的理论最大值（Vmax）均显著降低（P＜0.01）;反映心脏舒张功能的指标左心室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure, LVEDP）和左室压力最大下降速率（-dp/dtmax）均被显著抑制（P＜0.01）,表明模型组大鼠心脏的舒缩功能明显减弱,经过Nat1,3,9mg/kg/d以及Ipt3mg/kg治疗6周后,各组大鼠的心室舒缩功能得到明显改善。心室重构：与正常组相比,模型组大鼠的全心指数（heart weight/body weight, HW/BW）、左心指数（left ventricular weight/body weight, LVW/BW）、右心指数（right ventricular weight/body weight, RVW/BW）以及肺指数（lung weight/body weight, LW/BW）分别显著增加（P＜0.01）,表明心脏发生了明显的心室重构;模型组大鼠心肌细胞的横截面积（cardiomyocyte cross-section area）、心肌间质胶原容积分数（collagen volume fraction, CVF）、心肌羟脯氨酸含量（hydroxyproline）和正常对照组相比均明显增加（P＜0.05,P＜0.01vscontrol组）;模型组大鼠心肌组织的ANP、BNP mRNA的表达明显上调（P＜0.05vs control组）;经Nat1,3,9mg/k

关键词：纳他卡林心力衰竭 NO ET-1 前列环素内皮功能

埃他卡林新衍生物激活ATP敏感性钾通道的亚型选择性

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中国药理学通报 2008年第11期24卷 1427-1430页

作者：陈玉萍潘志远崔文玉汪海军事医学科学院毒物药物研究所北京100850 军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津300050 北京赛德维康医药研究院北京100850

目的研究埃他卡林新衍生物对不同亚型KATP通道的选择性作用。方法在特异性表达Kir6.2/SUR1、Kir6.2/SUR2A、Kir6.1/SUR2B3种不同亚型KATP通道的HEK-293细胞模型上,分别给予0.1、1.0、10、100×10-6mol.L-1的埃他卡林新衍生物,研究其作... 详细信息

目的研究埃他卡林新衍生物对不同亚型KATP通道的选择性作用。方法在特异性表达Kir6.2/SUR1、Kir6.2/SUR2A、Kir6.1/SUR2B3种不同亚型KATP通道的HEK-293细胞模型上,分别给予0.1、1.0、10、100×10-6mol.L-1的埃他卡林新衍生物,研究其作用前后DiBAC4(3)细胞荧光强度的变化,评价其对克隆表达的不同亚型KATP通道的选择性作用。结果7个埃他卡林新衍生物可激活KATP通道,其中衍生物(3)、(7)、(8)、(9)、(12)和(14)对3个亚型的KATP通道均具有激活作用,衍生物(7)对Kir6.2/SUR2A亚型的激活作用最强;衍生物(6)纳他卡林(natakalim)仅激活Kir6.1/SUR2B亚型,对Kir6.2/SUR2A和Kir6.2/SUR1亚型均无激活作用。结论纳他卡林为Kir6.1/SUR2B亚型高选择性开放剂。

关键词： KATP通道 HEK-293细胞纳他卡林埃他卡林衍生物

调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制

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调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能...

作者：赵刚中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

脑血管病,特别是其中最为常见的缺血性脑血管疾病严重危害人类健康。而溶栓后的再灌注过程可进一步加重缺血组织损伤。缺血及再灌注损伤的机制可能涉及能量代谢障碍、自由基损伤、细胞内及线粒体内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症... 详细信息

脑血管病,特别是其中最为常见的缺血性脑血管疾病严重危害人类健康。而溶栓后的再灌注过程可进一步加重缺血组织损伤。缺血及再灌注损伤的机制可能涉及能量代谢障碍、自由基损伤、细胞内及线粒体内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、线粒体损伤及细胞凋亡等。其中,对线粒体功能变化的研究成为心脑缺血性疾病研究领域的热点。线粒体(mitochondrion)是一种结构和功能复杂而敏感的细胞器,其主要功能之一是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)。氧化磷酸化是需氧细胞生命活动的主要能量来源,是生物体产生ATP的主要途径。因此缺血及再灌注损伤涉及的能量代谢障碍主要与线粒体的结构受损,氧化磷酸化能力下降或丧失有关,保护线粒体功能和结构的完整是药物发挥抗脑缺血活性的关键机制之一[1,2,3,4]。线粒体ATP-敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)自发现以来,其在缺血(再灌注)损伤及预适应中的作用备受关注。已经证实,mitoKATP通道开放后可通过多种机制保护缺血组织,减轻缺血缺氧及再灌注损伤[5,6,7]。因此,寻找新型mitoKATP通道开放剂,可能意味着寻找到新型神经及心脏保护药。脑缺血(再灌注)可引起脑内离子稳态失衡,导致神经细胞内和线粒体内Ca超载。线粒体内升高的Ca可通过诱导和加重活性氧(reactive oxygen species,ROS)的形成,开放线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),促进线粒体内凋亡相关因子释放等复杂的机制[8],最终诱导细胞凋亡,引起组织损伤。失衡的离子稳态引起组织损伤的病理及生化机制备受关注。埃他卡林是新型脂肪胺类ATP-敏感性钾通道开放剂,我室前期研究表明,其具有抗脑缺血损伤的作用[9,10]。纳他卡林是从埃他卡林衍生物中筛选出的选择性更高的ATP-敏感性钾通道开放剂[11]。基于线粒体能量代谢障碍在脑缺血损伤中的重要地位,而线粒体膜上也存在ATP-敏感性钾通道(mitoKATP),本文以线粒体呼吸功能为主要观测指标,探讨埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响及其与mitoKATP的关系,试图寻找新型mitoKATP通道开放剂。并对脑缺血(再灌注)损伤时脑内离子稳态失衡可能涉及的重要的内源性物质——二价金属阳离子对脑线粒体呼吸功能的影响作初步探究,思考其在脑缺血时引起病理损伤可能的生化机制。一、调节ATP-敏感性钾通道功能的药物对脑线粒体呼吸功能的影响 1.大鼠脑线粒体呼吸功能特征 (1)采用差速离心法,提取大鼠脑皮层线粒体。采用Clark氧电极法测定脑线粒体呼吸功能。所得线粒体结构完整,氧化磷酸化功能活性良好,可用于评价药物对其呼吸功能的影响。 (2)NADH呼吸链的耗氧速率,即电子传递速率低于FAD链(P他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响 (1)二氮嗪可显著抑制琥珀酸的氧化(P他卡林可抑制琥珀酸的氧化(P他卡林对FAD链显示不同的作用特点,即不影响R4,而加快R3(P他卡林对两条呼吸链的CI均有增强作用(P<0.05)。不加外源性底物,在ATP存

关键词：线粒体呼吸功能线粒体ATP-敏感性钾通道埃他卡林纳他卡林内源性物质镁离子钙离子

高原高寒环境因素对内皮细胞的损伤作用及其保护作用化合物研究

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高原高寒环境因素对内皮细胞的损伤作用及其保护作用化合物研究

作者：卫华中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

研究背景：我国高原面积广大，且大多处于边境地区，战略意义十分重要。高原特殊的地理环境和地貌特征造成了高原地区寒冷、低氧双重胁迫的环境特点。高原环境不但损害人体健康，更影响高原部队平战时的机动性和作训能力，因此解决高... 详细信息

研究背景：我国高原面积广大，且大多处于边境地区，战略意义十分重要。高原特殊的地理环境和地貌特征造成了高原地区寒冷、低氧双重胁迫的环境特点。高原环境不但损害人体健康，更影响高原部队平战时的机动性和作训能力，因此解决高原官兵健康问题是提高我军战斗力的必要环节。平原人初入高原时，由于氧气浓度骤减，机体发生了一系列的病理性变化，易患高原肺水肿、高原脑水肿，而久居高原的人由于长期缺氧代偿反应，易患肺动脉高压、高原性心脏病，而这些疾病的始动因子是内皮细胞的紊乱。另外，在高原高寒的环境下，野外作业时间可能引起全身性低体温（35～28℃），表现为外周血收缩、血液灌流减少、四肢易患冻伤，而此时最先受到损伤的仍是内皮细胞。因此保护内皮细胞，逆转内皮细胞功能紊乱成为防治高原疾病的新对策。纳他卡林（natakalim，Nat）是可高选择性的激活KATPSUR2B/Kir6.1亚型的先导化合物。前期研究已表明KATP的激活在高原肺水肿、高原脑水肿的防治上具有积极的作用，目前已知纳他卡林可以通过逆转内皮功能紊乱从而改善压力超负荷致心力衰竭，而关于纳他卡林对低氧所致的内皮细胞损伤的保护作用与保护机制的研究还甚少。因此研究低温、低氧及复合条件对机体的影响及其机制，并研究新型内皮细胞保护药物对抗低氧损伤的效果及其机理，具有重要的意义。研究目的：研究低温（28℃）、低氧（3%O2）、低温低氧复合三种条件下大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells，RAEC）的损伤规律，用2×2析因分析的方法阐明复合损伤与单因素损伤的区别及复合条件下的主要影响因素，为进一步认识高原高寒环境损伤提供理论依据。另外，针对ATP敏感性钾通道SUR2B/Kir6.1亚型选择性开放剂——纳他卡林，以急性低氧和高同型半胱氨酸（homocystein，HCY）作为损伤因素，研究药物的内皮细胞的保护作用及其机制。研究方法：采用主动脉血管片贴壁培养法，体外培养SPF级雄性Wistar大鼠胸主动脉内皮细胞。用MTT法测定细胞存活率、倒置显微镜观察细胞形态，确定低温损伤的有效作用时间。以21%O2、28℃培养30h为条件，研究低温对内皮细胞的损伤作用;以3%O2、37℃培养30h为条件研究低氧对内皮细胞的损伤作用;在研究低温低氧复合作用时，将内皮细胞分为正常对照组（21%O2、37℃）、低温模型组（21%O2、28℃）、低氧模型组（3%O2、37℃）、复合模型组（3%O2、28℃），同时孵育内皮细胞30h。用MTT法测定细胞存活率、硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）的释放、RT-PCR法检测细胞间粘附因子-1（ICAM-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、内皮素-1（ET-1）基因的表达水平;Hoechst33258和TUNEL法检测细胞凋亡;Western Blot法检测HIF-1α蛋白表达水平;通过透射电镜观察细胞超微结构。用析因分析的方法，阐明复合损伤与单因素损伤的区别，确定复合条件下的低温、低氧对内皮细胞影响的主次效应。在研究纳他卡林对低氧所致RAEC损伤的保护作用中，将细胞分为正常对照组、低氧模型组、纳他卡林低、中、高剂量组，格列本脲拮抗组。用MTT法测定细胞存活率、硝酸还原酶法检测NO的释放、黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力、RT-PCR法检测ICAM-1、VEGF、ET-1的基因表达水平;ELISA法测定ICAM-1、VEGF蛋白的表达水平。在研究纳他卡林对高HCY致RAEC损伤的保护作用中，用Realtime-PCR法检测血管细胞黏附因子（VCAM-1）、单核细胞趋化因子（MCP-1）和ICAM-1基因的表达水平。研究结果： 1.血管内皮细胞的培养和鉴定采用主动脉血管片贴壁的方法，培养出大鼠主动脉内皮细胞，经CD31免疫荧光鉴定，内皮细胞阳性率98%以上。 2.寒冷对血管内皮细胞的影响根据细胞存活率的测定和形态学的观察，确定30h为低温损伤的有效作用时间，因此将28℃孵育细胞30h作为研究低体温损伤的体外模型。研究发现低温具有明显的降低细胞增殖率，抑制细胞NO释放的作用，此外，低温在细胞凋亡和通透性方面具有一定的抑制作用，而在炎性因子的释放、内皮素基因表达方面有一定的促进作用，低温时可见细胞内质网发生扩张，呈大泡状。 3.高原低氧对内皮细胞的影响低氧可促进细胞凋亡、抑制NO释放，增强炎性因子和内皮素基因表达，可导致血管通透性增高，HIF-1α表达量增多，低氧时细胞超微结构的改变表现为线粒体肿胀、断裂，质膜小泡增多。 4.低温低氧复合因素对内皮细胞的影响低温低氧复合因素在细胞存活率、内皮活性因子的释放（NO、ET-1）、炎性因子表达、HIF-1α蛋白表达、细胞

关键词：低温低氧低温低氧复合血管内皮细胞纳他卡林同型半胱氨酸

ATP-敏感型钾通道开放剂血管内皮细胞保护效应分子途径的研究

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ATP-敏感型钾通道开放剂血管内皮细胞保护效应分子途径的研究