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纤溶酶原在单核细胞增生性李斯特菌脑膜炎中的作用机制研究

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纤溶酶原在单核细胞增生性李斯特菌脑膜炎中的作用机制研究

作者：王月郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的:纤溶酶原及其激活产物纤溶酶在纤维蛋白溶解、细胞外基质降解、细胞迁移、组织重塑、伤口愈合、促炎方面具有重要作用。有研究报道许多病原体能够挟持纤溶酶原系统通过纤溶酶原激活剂促进蛋白酶的后续激活、分解细胞外蛋白... 详细信息

背景与目的:纤溶酶原及其激活产物纤溶酶在纤维蛋白溶解、细胞外基质降解、细胞迁移、组织重塑、伤口愈合、促炎方面具有重要作用。有研究报道许多病原体能够挟持纤溶酶原系统通过纤溶酶原激活剂促进蛋白酶的后续激活、分解细胞外蛋白、破坏补体系统逃避宿主的免疫反应。单核细胞增生性李斯特菌的表面蛋白enolase（烯醇酶）、DnaK（热休克因子）、EF-TU（延伸因子TU）等也能与纤溶酶原结合,但具体作用未知。本研究的目的:1.旨在探究纤溶酶原在单核细胞增生性李斯特菌脑膜炎中的作用,为细菌性脑膜炎发病机制提供新的研究思路;2.确定细菌利用宿主纤溶酶原系统所涉及的作用体制,为以后更深入的研究提供较好的实验基础。方法:首先通过尾静脉注射细菌进行体内攻毒实验及细胞病理建立李斯特菌脑膜炎动物模型,然后通过实验组和对照组实验明确纤溶酶原系统在李斯特菌脑膜炎中的作用。体外实验中,使用脑血管内皮细胞建立体外血脑屏障模型,即通过设立实验组和对照组计算不同组别的细菌感染脑血管内皮后黏附和侵入量的变化情况。数据分析:统计学采用Graphpad Prism软件进行分析,计算各组组别的Mean±SEM,根据分析方法得不同采用Unpair t test或One-way ANOVA或two-way ANOVA进行分析;P-value＜0.05时为差异有统计学意义。结果:1.单核细胞增生性李斯特菌能够利用纤溶酶原增加自身的黏附和侵入增强致病性作用。实验组与对照组相比,差别有统计学意义。2.上述有利作用能够被氨基己酸所抑制,且抑制作用与氨基己酸的浓度成正相关。3.通过进行体外小鼠实验发现,不同处理组的小鼠在同一时间段血液、肝脏、脾脏的载菌量无统计学意义;实验组与对照组相比,小鼠脑中的载菌量及存活率差别有统计学意义。结论:单核细胞增生性李斯特菌能够利用宿主的纤溶酶原系统增加自身的致病性。

关键词：纤溶酶原单核细胞增生性李斯特菌脑膜炎血脑屏障

猪鼻支原体热不稳定延伸因子黏附宿主细胞机制的研究

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 990-995页

作者：李瑶王佳邵佳于岩飞袁厅刘蓓蓓冯志新邵国青屠志刚熊祺琰江苏大学生命科学学院江苏镇江212013 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210014 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

为研究热不稳定延伸因子(EF-Tu)在猪鼻支原体(Mhr)与宿主互作中的功能,本研究构建了重组质粒pET-EF-Tu并经PCR鉴定正确后,转化BL21(DE3)大肠杆菌后,通过IPTG诱导表达、镍柱亲和层析纯化获得纯化的重组蛋白rEF-Tu。将重组蛋白免疫家兔制... 详细信息

为研究热不稳定延伸因子(EF-Tu)在猪鼻支原体(Mhr)与宿主互作中的功能,本研究构建了重组质粒pET-EF-Tu并经PCR鉴定正确后,转化BL21(DE3)大肠杆菌后,通过IPTG诱导表达、镍柱亲和层析纯化获得纯化的重组蛋白rEF-Tu。将重组蛋白免疫家兔制备高免血清,采用ELISA方法检测其效价。利用该免疫血清通过western blot和菌落免疫杂交的方法分析EF-Tu在Mhr表面的表达情况,ELISA结果显示制备的多克隆抗体效价达1:200 000以上,且r EF-Tu可表达于Mhr表面;通过间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验检测rEF-Tu对猪肾细胞(PK-15)的黏附能力,结果显示rEF-Tu具有黏附能力且该黏附作用具有剂量依赖性;进一步利用微孔板的方法检测r EF-Tu蛋白结合于纤溶酶原和细胞外基质成分的能力,结果表明rEF-Tu蛋白可结合于宿主纤溶酶原以及不同的细胞外基质成分(纤连蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和玻连蛋白)。本研究结果表明EF-Tu可于Mhr表面表达、可黏附宿主细胞,并可结合纤溶酶原和多种细胞外基质成分,在Mhr的感染及致病中可能具有重要功能。

关键词：猪鼻支原体热不稳定延伸因子黏附纤溶酶原细胞外基质

DnaK和EF-Tu在猪鼻支原体劫持宿主纤溶系统突破细胞外基质屏障中的作用研究

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DnaK和EF-Tu在猪鼻支原体劫持宿主纤溶系统突破细胞外基质屏障中...

作者：李瑶江苏大学

学位级别：硕士

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)是猪上呼吸道常见病原体,临床感染率极高,在一定条件下可引发多发性浆膜炎(心包炎、胸膜炎和腹膜炎)、关节炎、肺炎、中耳炎等多组织炎症,严重影响经济收益。同时,Mhr被发现与胃癌等多种人类肿瘤有... 详细信息

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)是猪上呼吸道常见病原体,临床感染率极高,在一定条件下可引发多发性浆膜炎(心包炎、胸膜炎和腹膜炎)、关节炎、肺炎、中耳炎等多组织炎症,严重影响经济收益。同时,Mhr被发现与胃癌等多种人类肿瘤有关,可诱导肿瘤细胞迁移、侵袭能力增强和耐药,具有潜在的公共卫生威胁。本实验室前期数据及文献报道提示Mhr形成全身系统性感染在其致病过程中起关键作用,但Mhr突破屏障形成全身感染的具体机制有待阐明。本论文研究了Mhr劫持宿主纤溶系统帮助自身降解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)屏障的能力,并探讨了两种Mhr蛋白热休克蛋白DnaK和热不稳定延伸因子(Elongation factor unstable,EF-Tu)在菌体表面的兼职功能及其作为纤溶酶原受体(Plasminogen receptor,PlgR)在Mhr劫持纤溶系统突破ECM屏障中的作用。主要研究内容及结果如下:1.Mhr可劫持宿主纤溶系统水解并穿越ECM屏障:首先通过试验发现Mhr可结合多种ECM成分,包括纤连蛋白、层黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白及玻连蛋白;然后利用间接免疫荧光和ELISA方法定性、定量法检测发现Mhr可结合纤溶酶原(Plasminogen,Plg)至菌体表面;利用底物水解试验证明Mhr表面结合的Plg可被宿主Plg激活剂(tPA)活化为具有蛋白水解能力的纤溶酶(Plm),但Mhr本身不能直接活化Plg;进一步采用Transwell模型证明经Plg和tPA处理的Mhr可有效水解ECM,穿越ECM胶层屏障。2.DnaK蛋白作为Mhr表面PlgR之一帮助Mhr劫持纤溶系统,并具有黏附细胞、结合ECM功能:首先构建了表达rDnaK的重组大肠杆菌,表达纯化获得重组蛋白rDnaK,制备特异性高免兔血清;然后利用菌落免疫杂交和流式细胞术试验证明DnaK可在Mhr菌体表面表达;通过ELISA方法定量检测发现rDnaK蛋白可结合Plg,该结合可以被ε-氨基己酸竞争性抑制,利用底物水解试验证明rDnaK蛋白结合的Plg可被tPA活化为Plm,进一步研究显示rDnaK蛋白对Plg的活化过程具有促进作用,由此证明DnaK为Mhr表面的PlgR之一;通过间接免疫荧光和微孔板黏附试验证明rDnaK蛋白可以黏附猪源PK-15细胞和人源NCI-H292细胞,为Mhr黏附因子之一,同时rDnaK蛋白还可以结合多种ECM成分。3.EF-Tu蛋白作为Mhr表面PlgR之一帮助Mhr劫持纤溶系统,并具有黏附细胞、结合ECM功能:首先构建了表达rEF-Tu的重组大肠杆菌,表达纯化获得重组蛋白rEF-Tu,制备特异性高免兔血清;然后利用膜蛋白Western blot、菌落免疫杂交和流式细胞术试验证明EF-Tu可表达于Mhr菌体表面;通过ELISA方法定量检测发现rEF-Tu蛋白可结合Plg,该结合可以被ε-氨基己酸竞争性抑制,利用底物水解试验证明rEF-Tu蛋白结合的Plg可被tPA活化为Plm,进一步研究证明rEF-Tu蛋白对Plg活化过程具有促进作用,由此证明EF-Tu亦为Mhr表面的PlgR之一;通过间接免疫荧光和微孔板黏附试验证明rEF-Tu蛋白可以黏附猪源PK-15细胞和人源NCI-H292细胞,也为Mhr的另一种黏附因子,同时rEF-Tu也可以结合多种ECM成分。综上所述,本研究结果证明Mhr可以结合Plg利用宿主纤溶系统帮助自身水解突破ECM屏障,进一步研究发现DnaK和EF-Tu为两种Mhr表面PlgR,参与Mhr劫持纤溶系统,同时两者还具有黏附细胞和结合ECM的兼职功能,为多功能兼职蛋白,为后续全面鉴定Mhr的PlgR及研究其与纤溶系统的互作奠定了基础。本研究为解析Mhr系统性感染的相关机制提供了新的思路,也为Mhr致病机制的阐释和相关疫苗研发提供了重要参考。

关键词：猪鼻支原体纤溶酶原热休克蛋白70 热不稳定延伸因子细胞外基质

葡萄糖甘油二脂对纤溶酶原和纤溶酶原激活剂二级结构的影响

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光谱学与光谱分析 2010年第8期30卷 2171-2174页

作者：郝斐吴文惠瞿佳华包斌上海海洋大学食品学院上海201306

为研究葡萄糖甘油二脂(GDG)对纤溶酶原和纤溶酶原激活剂二级结构的影响。应用圆二色谱法(CD)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)研究了GDG对纤溶酶原和纤溶酶原激活剂二级结构的影响。在GDG分别与单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和链激酶相... 详细信息

为研究葡萄糖甘油二脂(GDG)对纤溶酶原和纤溶酶原激活剂二级结构的影响。应用圆二色谱法(CD)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)研究了GDG对纤溶酶原和纤溶酶原激活剂二级结构的影响。在GDG分别与单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和链激酶相互作用后,使其二级结构发生改变,不同浓度的GDG对一些纤溶因子的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲产生不同程度的影响。GDG对纤溶酶原和纤溶酶的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲没有明显影响。利用SDS-PAGE发现了GDG促进纤溶酶原/单链尿激酶型纤溶酶原激活剂相互转化的作用。从而可得出结论,GDG对单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和链激酶的活性产生影响,表明GDG通过改变单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的内因性活性来促进纤溶作用。

关键词：葡萄糖甘油二脂单链尿激酶型纤溶酶原激活剂纤溶酶原纤溶酶链激酶圆二色谱 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

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纤溶酶原：结构、功能与进化

中国海洋大学学报（自然科学版） 2010年第10期40卷 69-74页

作者：刘明英张士璀中国海洋大学海洋生物学系和海洋生物多样性与进化研究所海洋生命学院山东青岛266003

纤维蛋白溶解系统是凝血系统的重要组成部分,对于维持血液的流动性和血管的完整性起着至关重要的作用。作为纤溶系统中心组分的纤溶酶原在其激活剂的作用下转变为活性形式的纤溶酶,进而降解纤维蛋白原,并能溶解血栓。纤溶酶也参与金属... 详细信息

纤维蛋白溶解系统是凝血系统的重要组成部分,对于维持血液的流动性和血管的完整性起着至关重要的作用。作为纤溶系统中心组分的纤溶酶原在其激活剂的作用下转变为活性形式的纤溶酶,进而降解纤维蛋白原,并能溶解血栓。纤溶酶也参与金属蛋白酶类和脂氧合酶类激活作用,还与细胞许多迁移相关的生理和病理过程相关诸如癌症、血管增生、卵子成熟、胚胎发生、伤口愈合以及病原侵入相关。本文简要概述了纤溶酶原和纤溶酶的结构、功能及其进化的研究进展。

关键词：纤溶酶原纤溶酶纤溶系统纤溶酶原激活剂

基于“血不利则为水”理论探讨当归芍药散调控妊娠大鼠凝血功能及改善血栓前状态的机制研究

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临床医学研究与实践 2024年第16期9卷 19-22页

作者：赵丽华杨彦梅邰迎春陕西中医药大学附属医院陕西咸阳712000 陕西中医药大学陕西咸阳712046

目的基于“血不利则为水”理论探讨当归芍药散调控妊娠大鼠凝血功能及改善血栓前状态的作用机制。方法选取60只8周龄SD雌性大鼠,随机将其分为空白组、模型组、中药低剂量组[0.07 g/(100 g·d)]、中药中剂量组[0.14 g/(100 g·d)]、中药... 详细信息

目的基于“血不利则为水”理论探讨当归芍药散调控妊娠大鼠凝血功能及改善血栓前状态的作用机制。方法选取60只8周龄SD雌性大鼠,随机将其分为空白组、模型组、中药低剂量组[0.07 g/(100 g·d)]、中药中剂量组[0.14 g/(100 g·d)]、中药高剂量组[0.28 g/(100 g·d)]、西药组[20 IU/(100 g·d)],每组10只,均与健康雄性大鼠交配,妊娠第1天用盐酸肾上腺素加冰水法建立血栓前状态妊娠大鼠模型,造模过程中模型组2只大鼠死亡。比较六组的存活胚胎数、丢失胚胎数、胚胎丢失率;比较六组的纤维蛋白原(FIB)、抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)、D-二聚体(DD)和纤溶酶原(PLG)水平。结果模型组的存活胚胎数低于空白组,丢失胚胎数和胚胎丢失率高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);中药中剂量组、中药高剂量组、西药组的存活胚胎数高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);中药高剂量组、西药组的丢失胚胎数低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);中药中剂量组、中药高剂量组、西药组的胚胎丢失率低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组的FIB、DD和PLG水平高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组的FIB、DD和PLG水平低于模型组,AT-Ⅲ水平高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论当归芍药散能够降低血栓前状态模型大鼠的丢失胚胎数、胚胎丢失率及DD、PLG、FIB水平,提高存活胚胎数及AT-Ⅲ水平,保障胚胎的正常发育,改善血液高凝状态,促进微循环,从而达到抗血栓作用。

关键词：当归芍药散血栓前状态 D-二聚体纤维蛋白原纤溶酶原抗凝血酶-Ⅲ 妊娠结局

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人纤溶酶原/纤溶酶的研究进展

中国生物制品学杂志 2017年第2期30卷 204-209页

作者：岳胜兰李策生武汉生物制品研究所有限责任公司血液制剂研究室湖北武汉430207

人纤溶酶(plasmin,Plm)是人纤溶酶原(plasminogen,Plg)的活化形式,其为纤溶系统的重要组成部分。Plg/Plm的生理功能使其在临床中具有很好的应用前景,目前已有Plg/Plm产品进入临床试验阶段。本文就Plg/Plm转化机制、相关疾病及功能、临床... 详细信息

人纤溶酶(plasmin,Plm)是人纤溶酶原(plasminogen,Plg)的活化形式,其为纤溶系统的重要组成部分。Plg/Plm的生理功能使其在临床中具有很好的应用前景,目前已有Plg/Plm产品进入临床试验阶段。本文就Plg/Plm转化机制、相关疾病及功能、临床(前)研究以及生产工艺作一综述。

关键词：纤溶酶纤溶酶原纤溶系统

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双功能型纤溶酶的研究进展

华侨大学学报（自然科学版） 2023年第4期44卷 427-434页

作者：严慧周晶晶林宏峻唐明青华侨大学医学院福建泉州362021

综述双功能型纤溶酶(dFE)的物种来源,介绍双功能型纤溶酶的纯化工艺和酶活特性,为其进一步开发提供参考.结果表明:双功能型纤溶酶是一种同时具有纤溶酶原激活功能和纤维蛋白直接降解功能的新型纤溶物质,其来源广泛,多为微生物来源;分离... 详细信息

综述双功能型纤溶酶(dFE)的物种来源,介绍双功能型纤溶酶的纯化工艺和酶活特性,为其进一步开发提供参考.结果表明:双功能型纤溶酶是一种同时具有纤溶酶原激活功能和纤维蛋白直接降解功能的新型纤溶物质,其来源广泛,多为微生物来源;分离纯化工艺繁琐,以多层色谱为主;大多体现丝氨酸蛋白酶活性特征,受金属离子、pH值和蛋白酶抑制剂影响较大.

关键词：纤溶酶原纤维蛋白纤溶酶纤溶血栓

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大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T体外功能

微生物学报 2010年第1期50卷 48-53页

作者：惠长野郭妍吴书驰彭亮曹虹黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515 中国科学院深圳先进技术研究院深圳518054

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中... 详细信息

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中的ompT基因,构建ompT缺失突变株;二步柱层析纯化E44外膜组分,S-2251发色底物法测定其纤溶酶原激活活性;考察野生株E44、ompT基因敲除株E44ompT及转化带有ompT完整阅读框的质粒pUCT的E44ompT/pUCT三者对0.1mg/mL阳离子抗菌肽鱼精蛋白的敏感程度。【结果】利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建E44的ompT基因敲除株E44ompT;纯化得到约37kDa的E44外膜组分,S-2251发色底物法证实其具有纤溶酶原激活活性,纤溶酶原激活与膜组分的加入量呈一定量效关系;与野生株E44相比,ompT敲除株E44ompT对0.1mg/mL鱼精蛋白敏感,转化入带有ompT完整序列的质粒pUCT有一定的回补作用,E44ompT部分恢复抗鱼精蛋白能力。【结论】外膜蛋白T在致病株E44中有表达,并具有激活纤溶酶原及水解鱼精蛋白的活性。

关键词：外膜蛋白T 纤溶酶原激活鱼精蛋白水解