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Dvl2在不同流体切应力影响的初级纤毛发生中的作用

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Dvl2在不同流体切应力影响的初级纤毛发生中的作用

作者：王俊华遵义医学院

学位级别：硕士

目的:探索不同流体切应力对初级纤毛发生的影响;通过构建Dvl2(Dishevelled2)慢病毒干扰和过表达载体,探索Dvl2在此过程中的作用。方法:(1)构建可调控切应力的流体动力学体外细胞模型,将h UVECs分为静置培养组(Static,STA)、紊流切应力(D... 详细信息

目的:探索不同流体切应力对初级纤毛发生的影响;通过构建Dvl2(Dishevelled2)慢病毒干扰和过表达载体,探索Dvl2在此过程中的作用。方法:(1)构建可调控切应力的流体动力学体外细胞模型,将h UVECs分为静置培养组(Static,STA)、紊流切应力(Disturbed Flow,DF)和层流切应力(Unidirectional Shear Stress,USS)处理组;利用免疫荧光技术检测初级纤毛的表达定位,Real-time PCR技术和Western blot技术从分子水平检测初级纤毛相关基因和蛋白的表达。(2)免疫荧光共定位技术观察Dvl2与纤毛微管蛋白γ-tubulin的胞内位置关系;免疫共沉淀技术验证Dvl2与初级纤毛相关蛋白γ-tubulin、Bbs8的胞内互作关系;Real-time PCR检测不同FSS对Dvl2 m RNA相对表达量的影响。(3)构建慢病毒载体干扰Dvl2的表达量,筛选稳转细胞株,将细胞株分为Bc(Blank Control),Nc(Negative Control),sh-Dvl2(RNAi干扰组),OE-Dvl2(过表达Dvl2组)4个组;检测病毒感染效率,Real-time PCR和Western blot技术检测各组细胞的Dvl2表达量。(4)DF和USS分别作用于四组细胞;利用免疫荧光技术检测初级纤毛的表达定位,Real-time PCR技术和Western blot技术从分子水平检测初级纤毛相关基因和蛋白的表达。结果:(1)成功构建可调控的流体动力学体外细胞模型;免疫荧光技术可见,与STA组相比,DF作用时γ-tubulin表达定位显著升高(P纤毛微管蛋白γ-tubulin周围;免疫共沉淀结果可见Dvl2与Bbs8、γ-tubulin存在胞内互作关系。(3)构建慢病毒Nc(HBLV-GFP-PURO)、sh(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO sh RNA)、Dvl2(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO)成功,病毒滴度>1×108TU/m L,细胞感染率>98.6%;Real-time PCR检测结果可见,与Bc组相比,Nc组Dvl2 m RNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),sh-Dvl2组Dvl2 m RNA相对表达量显著降低(P0.05),sh-Dvl2组γ-tubulin表达定位显著升高(P0.05),sh-Dvl2组IFT88 m RNA相对表达量显著降低(P0.05),sh-Dvl2组IFT88蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bbs

关键词：初级纤毛纤毛发生 Dvl2 流体切应力慢病毒

hUVECs在不同切应力作用下的形态及纤毛发生

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生命科学研究 2015年第1期19卷 13-18页

作者：李秀毛生欣郭鹏飞陈城河何蕾遵义医学院附属医院胸心血管外科中国贵州遵义563000 遵义医学院生物化学教研室中国贵州遵义563000

分别应用紫杉醇荧光和免疫荧光标记法显示h UVECs(human umbilical vein endothelial cells,h UVECs)在不同切应力加载下微管骨架的装配动态及初级纤毛的形态发生。结果表明,以梯度切应力加载24 h,随着切应力增大,细胞由梭形逐渐变圆,... 详细信息

分别应用紫杉醇荧光和免疫荧光标记法显示h UVECs(human umbilical vein endothelial cells,h UVECs)在不同切应力加载下微管骨架的装配动态及初级纤毛的形态发生。结果表明,以梯度切应力加载24 h,随着切应力增大,细胞由梭形逐渐变圆,长宽比降低,胞质微管向细胞核周围集结并发生装配;14 dynes/cm2切应力加载48 h后,微管向切应力方向延伸导致细胞呈长梭型,微管停止装配;以15 dynes/cm2切应力加载28 h后,纤毛基体在细胞表面的定位不可见,纤毛微管解聚;再以1 dynes/cm2切应力加载18 h,又可观察到纤毛基体在细胞表面的重新定位。因此,切应力作用可诱导h UVECs形态变化,该变化经历了微管骨架的解聚、向细胞核方向聚集及重新装配过程;此外,切应力能够影响初级纤毛的形态发生,该现象可能导致了初级纤毛在心血管系统中的分布不均,并为"纤毛疾病"的治疗提供新的思路。

关键词：人脐静脉内皮细胞切应力微管类细胞骨架初级纤毛纤毛发生

TMEM216调控初级纤毛形成和Hedgehog信号通路的机制研究

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TMEM216调控初级纤毛形成和Hedgehog信号通路的机制研究

作者：姚辉丽山东大学

学位级别：硕士

初级纤毛上分布着信号受体,能将细胞外信号传递至细胞内,在组织发育和信号转导中发挥重要作用,初级纤毛结构缺陷或功能缺陷可诱发严重的纤毛病。哺乳动物Hedgehog(Hh)信号通路在很大程度上依赖初级纤毛,其关键组分动态定位于初级纤毛上... 详细信息

初级纤毛上分布着信号受体,能将细胞外信号传递至细胞内,在组织发育和信号转导中发挥重要作用,初级纤毛结构缺陷或功能缺陷可诱发严重的纤毛病。哺乳动物Hedgehog(Hh)信号通路在很大程度上依赖初级纤毛,其关键组分动态定位于初级纤毛上。因此,初级纤毛的结构缺陷常常导致Hh信号通路异常。跨膜蛋白TMEM216在初级纤毛形成中发挥作用,其基因突变引起Joubert和Meckel综合征(纤毛病),然而其作用机制还不清楚。本课题组在前期工作中构建了Tmem216敲除的C57BL/6小鼠,观察到小鼠胚胎或围产期死亡,并出现晶状体发育停滞、多囊肾、骨骼缺陷等纤毛病表型。对Tmem216+/+和Tmem216-/-小鼠胚胎样品的RNA-seq结果进行富集分析发现,TMEM216调控的很多基因与Hh信号通路相关。本课题旨在利用Tmem216敲除小鼠模型和细胞模型研究TMEM216在初级纤毛形成中的功能以及对Hh信号通路的影响。Western blot结果显示敲除TMEM216引起纤毛相关蛋白ARL13B和KIF3A以及Hh信号通路关键蛋白GLI1、GLI2水平下调,表明敲除TMEM216可能抑制初级纤毛形成和Hh信号通路。免疫共沉淀实验显示TMEM216与GLI2/GLI3、SUFU相互作用,并且过表达TMEM216导致SUFU与全长GLI2/GLI3的结合减弱。核质蛋白质分离分析显示敲除TMEM216抑制GLI2的核定位,促进GLI3-R的核定位,从而降低Hh信号通路的激活水平。恢复实验证明过表达SUFU下调了 TMEM216过表达导致的GLI1水平的升高程度,对TMEM216引起的ARL13B和KIF3A上调有回复作用。综上所述,TMEM216-SUFU-GLI2/GLI3轴可能在TMEM216缺失诱导的纤毛病和Hh信号转导中发挥重要作用。这些发现有助于理解TMEM216在初级纤毛形成和Hh信号通路中的功能以及TMEM216缺失诱导纤毛病的分子机制,从而有助于寻找靶向治疗纤毛病的策略。

关键词： TMEM216 初级纤毛 Hedgehog信号通路纤毛发生

ABCC4基因的突变影响纤毛的发生造成家猪的轴前多趾畸形

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ABCC4基因的突变影响纤毛的发生造成家猪的轴前多趾畸形

鞭毛内运输蛋白IFT25是小鼠精子发生和雄性生育所必需的

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：马成韩徐曼 Saber Khederzadeh Adeniyi C.Adeola 谢海兵张亚平中国科学院昆明动物研究所中国科学院遗传资源与进化国家重点实验室中国科学院大学生命科学学院昆明分院中国科学院大学

多趾（polydactyly）是一种最为常见的先天性肢体发育异常,在许多物种中均有发生,其形成原因与多个基因相关,然而其致畸的分子机制尚未十分明确。本文发现了一个具有3头轴前多趾（preaxial polydactyly, PPD）患病个体和13头正常个体的... 详细信息

多趾（polydactyly）是一种最为常见的先天性肢体发育异常,在许多物种中均有发生,其形成原因与多个基因相关,然而其致畸的分子机制尚未十分明确。本文发现了一个具有3头轴前多趾（preaxial polydactyly, PPD）患病个体和13头正常个体的大白猪家系,以及另外一头PPD大白母猪。通过对这两个家系全部个体进行高深度的全基因组重测序,我们定位了PPD的候选基因。分析结果显示,PPD性状与一个编码跨膜转运蛋白参与纤毛形成过程的基因——ABCC4具有很强的关联性。单倍型分析表明,患病个体在ABCC4基因中共享较长的单倍体类型。此外,我们在ABCC4基因中发现了一个编码高度保守的蛋白结构域的异义突变（I85T）位点,并且该突变位点在患病个体与正常个体间表现出高度分化,而前人相关研究报道的候选基因在本研究中没有发现与该多趾性状相关。本研究结果突出了纤毛形成在PPD形成过程中的作用,并为PPD的研究提供了一个新的候选基因。

关键词：轴前多趾 ABCC4 纤毛发生 SHH

来源： cnki会议评论

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鞭毛内运输蛋白IFT25是小鼠精子发生和雄性生育所必需的

作者：刘红武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:研究鞭毛内运输蛋白25（Ift25）对小鼠精子鞭毛的形成的影响以及对雄性生育的作用。方法:***25flox/flox的雌性小鼠与Stra8-i Cre雄鼠杂交得到stra8-i Cre;Ift25flox/-;***-PCR检测IFT25基因在小鼠不同组织中m RNA的表达;3;Western... 详细信息

目的:研究鞭毛内运输蛋白25（Ift25）对小鼠精子鞭毛的形成的影响以及对雄性生育的作用。方法:***25flox/flox的雌性小鼠与Stra8-i Cre雄鼠杂交得到stra8-i Cre;Ift25flox/-;***-PCR检测IFT25基因在小鼠不同组织中m RNA的表达;3;Western Blot检测不同蛋白在小鼠不同组织及敲除小鼠与对照小鼠中的蛋白表达情况;***染色检测Ift25基因敲除小鼠附睾及睾丸中精子发生不同阶段的形态变化;5.生精细胞切片制备:生精细胞切片染色观察精子鞭毛附属结构;***观察精子的超微结构变化及TEM观察附睾及睾丸的超微结构变化;8.酵母双杂交实验及免疫共沉淀实验是检测蛋白之间的相互作用;9.统计分析精子计数、精子运动速率、活精子比率等统计指标。结果:在雄性小鼠中,Ift25基因在睾丸组织中高度表达,并且在精子发生的第三阶段（精子鞭毛形成阶段）表达量呈上升趋势。为了探索Ift25在精子鞭毛形成中的作用,本研究在雄性生殖细胞中特异性敲除这个基因。结果发现与野生型小鼠相比,所有Ift25基因敲除小鼠都能够活到成年,并没有任何生长异常。然而,生育能力测试表明所有的基因敲除小鼠表现出完全不育。统计分析表明在Ift25基因基因敲除小鼠中精子数量明显下降,且完全丧失运动能力。HE染色发现Ift25基因敲除小鼠曲精小管管腔中生精细胞数量明显下降,排列紊乱,成熟阶段的精子很少。光镜下观察到多种异常的精子形态,如圆形的头部,短而弯曲或末端肿胀的尾巴,分枝的鞭毛及异常增厚的鞭毛。透射电镜下观察到的精子异常表型与光镜下的形态变化一致。扫描电镜显示Ift25基因敲除的小鼠绝大多数发育成熟的精子失去“9+2”结构及附属结构,包括外层致密纤维,纤维鞘和线粒体鞘也被破坏。在Ift25基因敲除的小鼠附睾精子中,纤维鞘的主要组成成分AKAP4不表达;而外层致密纤维的组成成分之一ODF2仍然存在,但其定位的附属结构包括外层致密纤维和纤维鞘也被破坏。在Ift25基因敲除小鼠中,Ift27,是Ift25的一个相互作用蛋白,也完全消失。而且我们检测的其他Ift蛋白中,Ift20和Ift81在Ift25基因基因敲除小鼠中表达量明显下降,而Ift74和Ift140的表达量却没有明显变化。结论:鞭毛内运输蛋白25（Ift25）是小鼠精子鞭毛形成和雄性生育所必需的蛋白,在调节精子发生过程中起着重要的作用。

关键词：鞭毛内运输蛋白纤毛发生生精细胞精子发生鞭毛形成