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热带作物学报 2011年第4期32卷 738-742页

作者：张培关磊刘蕤蒲雪莲邓晓玲华南农业大学资源环境学院植物病理系广东广州510642

利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对广东清远、四会、云浮地区砂糖橘90个红鼻子果样品进行检测。结果表明,韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)阳性检出率高达100%。分别对病树上无症状果实、斑驳叶片以及黄化叶片样品进行实... 详细信息

利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对广东清远、四会、云浮地区砂糖橘90个红鼻子果样品进行检测。结果表明,韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)阳性检出率高达100%。分别对病树上无症状果实、斑驳叶片以及黄化叶片样品进行实时荧光定量PCR检测,阳性检出率分别为27.3%、91.8%、52.0%,因此,可将砂糖橘红鼻子果作为田间诊断黄龙病的典型症状。红鼻子果的果柄和果轴均可检测到病原,且果柄部位病原浓度明显高于果轴。对红鼻子果果柄韧皮部扫描电镜观察,发现果柄筛管中有大量淀粉粒沉积,且韧皮部筛管明显缢缩,阻碍了植株体内糖分和有机质向果实运输。

关键词：砂糖橘黄龙病红鼻子果 Candidatus Liberibacter asiaticus TaqMan实时荧光定量PCR

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柑橘黄龙病菌的富集方法及效果评价

柑橘黄龙病菌的富集方法及效果评价

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作者：李桃华南农业大学

学位级别：硕士

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具有毁灭性的病害之一,对柑橘产业造成了巨大的经济损失,目前普遍认为柑橘黄龙病菌为候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.),该病菌目前暂无法进行离体人工培养,很难从病原... 详细信息

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具有毁灭性的病害之一,对柑橘产业造成了巨大的经济损失,目前普遍认为柑橘黄龙病菌为候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.),该病菌目前暂无法进行离体人工培养,很难从病原菌的生物学、形态学等方面进行研究。近年来,基因组学的发展促进了黄龙病菌相关研究,而要获得高质量基因组的关键是要获得含有高浓度的黄龙病菌材料,本研究利用菟丝子介导以及对感染黄龙病的果实进行不同时间的离体保存等方法对黄龙病菌进行了富集,以提高黄龙病菌在寄主中的浓度,并对富集效果进行评价,得到的结果如下:1.利用菟丝子接合4个品种的离体柑橘枝条(共55组实验组)对黄龙病菌进行快速富集,在55组实验组中,菟丝子寄生在柑橘枝条上的生长形态可分为4种类型:Type I(7组/12.6%)、Type II(21组/38.2%)、Type III(17组/30.9%)与Type IV(10组/18.2%);共有48组实验组中的菟丝子寄生在柑橘枝条上存活,其中有30组实验组的菟丝子中CLas的含量高于其寄主中的含量,定量分析显示菟丝子对CLas富集的倍数可比柑橘高出2～419倍;对CLas产生较好富集效果的菟丝子生长类型多为Type III与Type IV类型;当菟丝子寄生时间在13～17 d之间时,富集效果可以达到较好的水平且富集水平比较稳定集中;另外在4个柑橘品种中,对CLas产生较好富集效果的柑橘枝条品种多为年桔和砂糖橘枝条。2.选取三组来源于柑橘及其寄生的菟丝子的CLas DNA进行全基因组测序,分别比较来源于柑橘与菟丝子的CLas基因组测序拼接质量。结果表明:测序数据中,来源于菟丝子Hi Seq数据中的CLas reads条数比柑橘Hi Seq数据中高6～33倍。利用菟丝子Hi Seq数据拼接得到的CLas contigs数量要比利用柑橘Hi Seq数据拼接得到的CLas contigs数量少,并且CLas contigs N50均明显高于来源于柑橘Hi Seq数据的CLas contig N50。经菟丝子富集后测序得到的基因组质量要高于直接从柑橘上测序得到的基因组质量,并且短时间内黄龙病菌从柑橘传至菟丝子基因组并没有发生变异。3.选取5对CLas细胞分裂及DNA复制相关看家基因对CLas传入菟丝子后不同时期的表达水平进行分析,并与其寄主中的表达水平进行比较。结果表明:随着菟丝子在柑橘上寄生时间的增加,在菟丝子中5对基因的表达量逐渐增加,并且在菟丝子寄生15 d后,5对看家基因的含量在菟丝子中的表达量显著高于在柑橘中的含量(P<0.05)。这表明CLas在传入菟丝子后进行了快速的增殖。4.基于含CLas的离体砂糖橘果实对CLas进行富集,病果在离体14 d后,总DNA,寄主DNA以及CLas DNA含量均会下降,但CLas DNA在总DNA中所占比例会有所上升,CLas的拷贝数达到较高水平。在离体28 d后,离体病果与树上病果相比,颜色差异较大,离体病果几乎完全转色,而树上病果果实颜色仍有青绿色。5.采用染病橘络DNA样本和染病叶中脉DNA样本进行CLas的全基因组测序与拼接时,在CT值相近的情况下,相比于感染CLas的叶中脉DNA样本,来源于橘络的测序数据中CLas reads所占比例较高(5.39%),Coverage较高(494X),CLas contigs条数少(33条),平均长度长(36943 bp)。采用感染CLas的橘络DNA样本作为CLas基因组测序材料,能大大提高测序和拼接后的CLas基因组质量。综上所述,基于菟丝子介导和离体病果介导的黄龙病菌富集方法均在一定程度上提高黄龙病菌在寄主中的浓度,为获得高浓度黄龙病菌提供重要的方法,并为后续CLas基因组学的深入研究奠定了坚实的基础。

关键词：柑橘黄龙病菌菟丝子病原菌富集全基因组测序分析红鼻子果

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