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红芸豆植物凝集素（RKBL）终止小鼠中期妊娠作用机理的初步研究

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红芸豆植物凝集素（RKBL）终止小鼠中期妊娠作用机理的初步研究

作者：杨成焕云南师范大学

学位级别：硕士

凝集素是一种无免疫原性的蛋白质,广泛存在于动物、植物和微生物中。植物凝集素不仅具有凝集细胞的作用,并且参与体内一些重要的生理过程,已经广泛应用于农业、畜牧业及医药等行业。凝集素受体是存在于细胞膜表面的糖蛋白或糖脂,可以与... 详细信息

凝集素是一种无免疫原性的蛋白质,广泛存在于动物、植物和微生物中。植物凝集素不仅具有凝集细胞的作用,并且参与体内一些重要的生理过程,已经广泛应用于农业、畜牧业及医药等行业。凝集素受体是存在于细胞膜表面的糖蛋白或糖脂,可以与相应的凝集素发生特异性的结合。许多实验证据表明,凝集素受体在受精、妊娠等生殖过程中有具有重要的影响和作用。芸豆植物凝集素(kidney bean lectin,KBL)是从芸豆中提取的糖蛋白,其特异性结合糖为β-半乳糖、α-甘露糖和α-乙酰葡萄糖胺。本实验室以往的研究发现KBL具有抑制受精、终止不同时期妊娠的作用,但对其机理还缺乏较为系统和全面的研究。因此,本研究从整体、组织、细胞及分子水平进行了一些相关的研究。目的:探究KBL在终止小鼠妊娠过程中对相关性激素、胎盘和子宫的影响,为研究KBL终止妊娠的机制提供实验依据。同时,考虑将来的临床应用,也研究了不同性别的小鼠对KBL的耐受性。以期为生殖医学和研究新型避孕药提供基础实验依据。方法:1、通过非手术法子宫给药的方式观察红芸豆植物凝集素(Red kidney bean lectin,RKBL)在终止昆明小鼠妊娠过程中对生殖内分泌激素的影响。2、对RKBL处理的小鼠胎盘进行形态学观察、台盼蓝染色、甲基绿-派诺宁染色、DNA电泳、TUNEL检测,8-异前列腺素F2α的测定,了解RKBL在终止小鼠妊娠过程中对胎盘的影响。3、通过测定并比较培养乳酸菌和盘基网柄菌前后的培养基中RKBL的凝集活性和分子的完整性。4、选用经口(限量试验)和经腹腔(LD50测定)两种方式对RKBL进行了急性毒性试验。结果:1、在性激素变化方面,应用RKBL终止妊娠过程中孕鼠血清中E2、FSH、LH和T无明显变化;P和PRL在注射RKBL后呈先升高后降低的趋势,并且在对照组与实验组间差异显著;胎盘匀浆的8-iso-PGF2α水平无明显变化,而子宫匀浆8-iso-PGF2α水平在给药后明显下降。2、在组织水平,RKBL可导致妊娠小鼠胎盘出现充血和坏死的现象,胎盘边缘有明显台盼蓝染色;3、在细胞和分子水平,甲基绿-派诺宁染色与TUNEL检测、DNA电泳条带显示胎盘出现坏死和凋亡现象;4、在作用方式上,RKBL在促进乳酸菌和盘基网柄菌增殖的同时其凝集活性和含量不会降低。5、不同性别的急性毒性试验结果表明,腹腔单次注射RKBL,雌鼠LD50为743.242 mg/kg,其95%可信区间为658.053～848.953 mg/kg;雄鼠LD50为535.452 mg/kg,其95%可信区间为480.961～598.818 mg/kg;限量试验结果大于5000 mg/kg。结论:1、使用RKBL终止小鼠中期妊娠时不改变孕鼠体内的E2、FSH、LH、T和8-异前列腺素F2α水平,而对P和PRL有较大影响,提示RKBL终止小鼠妊娠不是通过影响整体神经内分泌轴(下丘脑-垂体-靶腺轴)的下丘脑及垂体水平而实现。2、注射RKBL后引起小鼠胎盘坏死、凋亡或副凋亡,提示RKBL终止妊娠主要是通过引起胎盘坏死、凋亡或副凋亡途径实现的。3、RKBL能够在细胞外促进乳酸菌和盘基网柄菌增殖,且这种增殖作用主要是通过细胞外信号传递方式,RKBL本身不会作为能源物质被利用或降解。4、RKBL的属于低毒,对不同性别的昆明小鼠具有量效作用差异。单次腹腔注射RKBL,雌鼠的耐受性高于雄鼠。

关键词：红芸豆植物凝集素小鼠终止妊娠机理性别毒性

红芸豆植物凝集素凝胶剂杀精与凝集精子效果的实验研究

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中国计划生育学杂志 2017年第10期25卷 654-657页

作者：王静静姚娅婷李阔郑永张田王敏康云南省生物质能与环境生物技术重点实验室生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南师范大学生命科学学院昆明650500

目的:探讨红芸豆植物凝集素(RKBL)凝胶剂的杀精和凝集精子的效果。方法:(1)采用Sander-Cramer方法,即在浓度为5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001mg/ml的RKBL溶液中,分别加入等体积精液,观察20s内致死精子的最低RKBL浓度及精子凝集的有效浓度;(2)在"V"型管底部加入等体积RKBL浓度分别为5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001mg/ml的凝胶剂,在V型管两侧加入等体积人输卵管培养液(HTF),然后在其中一侧HTF中加入等量精液,观察阻止精子穿过或致死精子的效果。结果:当RKBL的浓度≥1mg/ml时,精子瞬间失活致死,即20s内致死的最低剂量为1mg/ml;>0.01mg/ml的各浓度RKBL可不同程度地凝集精子。在"V"形管中,上述不同浓度的RKBL凝胶剂均能阻止精子穿透;当RKBL浓度≥1mg/ml时,精子在凝胶附近完全失去活动能力。结论:RKBL溶液体外杀精的最低浓度为1mg/ml;部分低浓度RBKL能使精子产生不同程度的凝集;各实验浓度的RKBL凝胶剂均能阻止精子穿透。RKBL凝胶剂可有效用于避孕。

关键词：红芸豆植物凝集素杀精剂精子凝集精子穿透凝胶剂

磨芋低聚甘露糖和红芸豆植物凝集素对小鼠学习记忆和情绪相关神经行为的影响

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磨芋低聚甘露糖和红芸豆植物凝集素对小鼠学习记忆和情绪相关神经...

作者：马艳芳云南师范大学

学位级别：硕士

磨芋低聚甘露糖(KMOS)是一种重要的益生元,可改善肠道微生态,促进机体健康,但其是否具有神经中枢作用尚且未知。本文以KM小鼠为对象,探讨了KMOS对学习和记忆及情绪相关行为的作用。50只雄性成年昆明小鼠,分为5组,分别灌胃KMOS(0(对照)、... 详细信息

磨芋低聚甘露糖(KMOS)是一种重要的益生元,可改善肠道微生态,促进机体健康,但其是否具有神经中枢作用尚且未知。本文以KM小鼠为对象,探讨了KMOS对学习和记忆及情绪相关行为的作用。50只雄性成年昆明小鼠,分为5组,分别灌胃KMOS(0(对照)、650、1400、3000或6500 mg/kg)30d,然后顺序进行神经行为训练和测试(旷场、高架十字迷宫、被动回避、Morris水迷宫和强迫游泳),并取脑、肠、脾和胸腺等进行组织学检查或脏器系数测量。结果表明:(1)旷场:与对照组相比,KMOS3000 mg/kg组动物进入中央区域次数明显增加。(2)高架十字迷宫:3000 mg/kg组进入开放臂次数显著高于对照组。(3)被动回避:各组测试潜伏期较训练时均显著增加,但无明显组间差异。(4)水迷宫:训练和测试两阶段均无明显组间差异。(5)强迫游泳:不动时间无明显组间差异。(6)海马:各KMOS剂量组腹侧海马CA3区神经元密度较对照组显著增加。(7)肠道绒毛:与对照组相比,6500 mg/kg组回肠绒毛直径与高度均显著增加。(8)脏器系数:KMOS各剂量组脾脏指数均显著高于对照组。以上结果提示,KMOS可降低小鼠的焦虑样行为,提高腹侧海马CA3神经元密度,改善肠道黏膜绒毛形态。红芸豆植物凝集素(PHA)能刺激机体产生神经白细胞素(NLK)。NLK可促进神经发育、轴突生长/再生及神经元存活。但PHA是否对小鼠学习和记忆、情绪相关行为有影响尚且未知。采用亚硝酸钠和D-半乳糖组合处理法(皮下注射)构建小鼠记忆损伤模型。亚硝酸钠剂量为90 mg/kg,D-半乳糖剂量为120mg/kg,共处理40 d。雌性成年昆明小鼠60只,分为6组,每组10只,包括对照组、模型组、脑复康(Pira)组(500 mg/kg,灌胃),PHA处理组(PHA50、PHA150、PHA450组,分别灌胃50、150或450 mg/kg PHA)。Pira组和PHA处理组在造模开始10 d后开始饲喂药物,共处理30 d。结果:神经行为实验(1)旷场:模型组理毛次数较对照组显著减少,但PHA和Pira处理无明显影响。(2)物体辨别实验:所有动物均可分辨新旧物体,但无明显组间差异。(3)Morris水迷宫:测试阶段,模型组穿越平台区域次数较对照组略有减少,但Pira和50、150mg/kg PHA处理可使平台区域穿越次数较模型组显著提高。(4)高架十字迷宫:PHA50组动物在开放臂活动时间较对照组和模型组均显著增加。(5)强迫游泳:无明显组间差异。(6)力竭实验:PHA50组和PHA150组力竭时间较对照组显著增加。(7)出血实验:与对照组和模型组相比,PHA50组出血时间显著缩短。以上结果提示,PHA可改善KM小鼠记忆损伤模型的空间记忆,并有一定抗焦虑、增强耐力和促进凝血作用。

关键词：磨芋低聚甘露糖红芸豆植物凝集素学习和记忆情绪相关行为 KM小鼠

红芸豆凝集素的一些药效学基础及致癌性试验研究

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红芸豆凝集素的一些药效学基础及致癌性试验研究

作者：郑永云南师范大学

学位级别：硕士

凝集素(lectin)是一种能促进细胞凝集的蛋白质,在动植物以及微生物中广泛存在。其中豆科植物的凝集素最为丰富,是由2或4个单体组成,每个单体的分子量大约在25～30 KD之间,并且有一个结合糖位点。植物凝集素的糖结合专一性决定了其在相... 详细信息

凝集素(lectin)是一种能促进细胞凝集的蛋白质,在动植物以及微生物中广泛存在。其中豆科植物的凝集素最为丰富,是由2或4个单体组成,每个单体的分子量大约在25～30 KD之间,并且有一个结合糖位点。植物凝集素的糖结合专一性决定了其在相关作用及性质方面的诸多优势。本研究所用红芸豆(Phaseolus vulgaris L.)植物凝集素(Red kidney bean lectin,RKBL or phytohem-agglutinin,PHA)是从云南本地产红芸豆中提取的。已有的研究表明,芸豆植物凝集素(Kidney bean lectin,KBL)能够安全有效地阻止受精,终止不同时期的妊娠,抗HIV的作用。有可能开发成为一种既有避孕,又有预防性传播疾病包括HIV作用的阴道或直肠用杀微生物剂。作为需要长期使用的药物,其安全性尤为重要。因此,我们还需要了解KBL的致癌性,抗肿瘤等方面的性质,但目前已有的相关文献资料很少或缺失。因此,本学位论文主要对红芸豆植物凝集素(RKBL)作为长期应用的药物的安全性、致癌性、作为靶向给药载体的可行性和抑制围着床期胚胎植入的相关通路及机理进行了初步研究。本研究的方法:1、对于雌兔和雄兔分别进行阴道及直肠给注入红芸豆凝集素(RKBL)凝胶剂和壬苯醇醚凝胶。雌兔为每次经阴道注入2ml/30mg,雄兔每次经肛门注入4ml/60mg的红芸豆凝集素凝胶剂。2、RKBL对黑色素瘤细胞B16及QGY-7701(人肝癌细胞)形态学的影响,采用MTT法检测RKBL对黑色素瘤细胞B16及QGY细胞增殖的影响,FITC-RKBL制备及对肿瘤细胞的作用。3、通过对雌鼠进行阴道或对雄鼠进行直肠连续给药,研究RKBL的致癌性。4、通过比较注射RKBL处理的妊娠小鼠与对照小鼠组子宫中转录因子STAT3表达量,初步探究RKBL对影响床期胚泡植入及终止妊娠的相关通路。结果:实验1:RKBL凝胶剂给药组的雌兔阴道和雄兔直肠黏膜上皮细胞均保持结构完整;而使用壬苯醇醚凝胶的雌兔阴道和雄兔直肠黏膜上皮细胞均表现出不同程度的破损。实验2:红芸豆植物凝集素(RKBL)对肿瘤细胞具有抑制作用,且肿瘤细胞表面含有大量的KBL或PHA受体,RKBL可诱导肿瘤细胞发生凋亡和副凋亡现象。实验3:实验结果表明18个月的长期阴道给以红芸豆植物凝胶剂是安全的,对小鼠致癌性无影响;对小鼠的脏器系数、血液、肝肾功能等与对照组对比虽然个别指标呈现显著性差异,但是都在正常参考值范围内波动。实验4:注射RKBL的受孕小鼠子宫内膜中STAT3表达量较对照组受到抑制,高剂量组子宫内膜STAT3的表达随注射后时间的延长呈递减状态。结论:1、RKBL凝胶剂作用于雌兔阴道和雄兔直肠不会对上皮细胞造成破损,在开发成为新型杀微生物剂中具有良好前景。2、RKBL对肿瘤细胞具有抑制增殖和致死作用,肿瘤细胞表面含有大量的RKBL受体,这为RKBL作为靶向给药提供了有力的依据。3、在历时18个月的致癌性试验中,长期注射RKBL对小鼠是安全的,无致癌作用。高剂量组雌鼠脾脏系数,子宫系数较对照组增高或降低,具有显著差异;中剂量组中肾上腺系数和膀胱系数较对照组具有显著差异;低剂量组中肾上腺系数较对照组具有显著差异。高剂量组、中剂量组、低剂量组部分脏器系数较对照组出现差异,其余脏器系数均不显著(P>0.05)。RKBL组小鼠生长情况稳定,无特殊组织病理现象,体重、血液学及生化检验与对照组相比,均无明显差异(P>0.05)。4、注射RKBL的妊娠小鼠其子宫中STAT3表达量较对照组受到抑制,由此可以推断红芸豆植物凝集素在妊娠方面的一个可能途径是通过抑制STAT3的激活和STAT3的表达,进而达到终止妊娠的结果。

关键词：红芸豆植物凝集素小鼠杀微生物剂肿瘤致癌性 STAT3

长期注射RKBL凝胶剂对兔阴道及直肠上皮细胞影响的研究

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中国预防医学杂志 2018年第1期19卷 43-48页

作者：郑永王静静姚娅婷蹇明国张田王敏康云南省生物质能与环境生物技术重点实验室生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南师范大学生命科学学院云南昆明650500

目的对比长期使用红芸豆植物凝集素(red kidney bean lectin,RKBL)和壬苯醇醚(nonoxynol,N-9)对雌性兔阴道及雄性兔子直肠黏膜上皮细胞的影响。方法使用相同浓度的RKBL凝胶剂和N-9,分别于雌兔阴道和雄兔直肠连续给药6个月。然后经耳缘... 详细信息

目的对比长期使用红芸豆植物凝集素(red kidney bean lectin,RKBL)和壬苯醇醚(nonoxynol,N-9)对雌性兔阴道及雄性兔子直肠黏膜上皮细胞的影响。方法使用相同浓度的RKBL凝胶剂和N-9,分别于雌兔阴道和雄兔直肠连续给药6个月。然后经耳缘静脉注射空气处死兔子,取出阴道及雄兔的直肠组织进行固定,制作石蜡切片。显微镜下观察不同处理组阴道和直肠组织的细胞形态学变化。结果 RKBL凝胶剂给药组的雌兔阴道和雄兔直肠黏膜上皮细胞均结构保持完整;而使用N-9凝胶的雌兔阴道和雄兔直肠黏膜上皮细胞均表现出不同程度的破损。结论长期使用RKBL对阴道和直肠黏膜上皮细胞无损伤作用。

关键词：红芸豆植物凝集素壬苯醇醚杀微生物剂兔子阴道直肠上皮细胞切片