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水稻TFIIB家族OsBRP1转录因子的功能研究

水稻TFIIB家族OsBRP1转录因子的功能研究

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作者：宁鹤中国计量大学

学位级别：硕士

转录是基因表达中最重要的一步,通常认为真核生物核基因转录的基本途径是高度保守的。真核生物中,TFIIB是RNA聚合酶II的关键通用转录因子,协助蛋白编码基因转录,通常只有两个同源蛋白,作为RNA聚合酶I和III的通用转录因子,但在植物中则... 详细信息

转录是基因表达中最重要的一步,通常认为真核生物核基因转录的基本途径是高度保守的。真核生物中,TFIIB是RNA聚合酶II的关键通用转录因子,协助蛋白编码基因转录,通常只有两个同源蛋白,作为RNA聚合酶I和III的通用转录因子,但在植物中则数目众多,拟南芥和水稻中各有14个和9。拟南芥中少量研究表明TFIIB转录因子家族在进化过程中扩增并产生功能多样化。但这些研究仅限于拟南芥,其它植物中尚未见报道。水稻是当今世界上最主要的粮食作物之一,也是单子叶植物研究的模式生物。明确水稻与其他真核生物转录系统的差异,对增强和完善真核生物通用转录因子和转录系统现有学说非常重要。本研究以水稻TFIIB相关蛋白Os BRP1为研究对象,研究了其系统表达模式、亚细胞定位、在生长发育和环境响应中的功能、与TBP（TATA结合蛋白）的互作情况等,主要研究结果如下:（1）系统表达模式研究将Os BRP1基因启动子序列克隆到1300-NH-GUSPlus载体上,遗传转化获得转基因植株,从中筛选出阳性苗进行GUS染色。结果显示:Os BRP1在生殖器官和幼叶中表达量较高,暗示其可能在植物生殖生长中发挥作用。对野生型日本晴幼苗进行盐胁迫处理后,发现Os BRP1的表达量显著上升,暗示该基因的表达受盐胁迫响应诱导。（2）亚细胞定位分析将Os BRP1蛋白克隆至1300UR-s GFP载体上,在烟草中瞬时表达后观察亚细胞定位情况。结果显示Os BRP1蛋白定位在内质网,而不是细胞核。为了鉴定Os BRP1的内质网定位信号,将Os BRP1蛋白分成C端和N端结构域,结果显示C端结构域在细胞核中表达,N端结构域在内质网中表达,表明Os BRP1 N端的内质网定位信号掩盖了C端的核定位信号的活性。（3）CRIPSR/Cas9敲除载体的构建及突变植株鉴定为了明确Os BRP1蛋白在生长发育及环境响应中的功能,构建了水稻CRISPR/Cas9基因编辑重组载体,遗传转化获得转基因植株。利用PCR和测序共同鉴定出阳性苗,并通过自交筛选出纯合移码突变,共筛选出3种不同类型的纯合移码突变体（osbrp1-6、osbrp1-24、osbrp1-50）。（4）osbrp1突变体生长发育和环境响应表型分析对获得的osbrp1突变体植株进行了初步的生长发育表型观察,发现在幼苗期没有明显的表型差异,但在生殖生长期osbrp1突变体在株高、穗长、分蘖数、籽粒长度等方面比野生型都显著降低。此外,观察水稻osbrp1在盐胁迫下的表型性状和生理生化变化,发现相比与野生型,osbrp1突变体在盐胁迫下叶片黄化枯萎程度更高,存活率更低,株高、生物量和叶绿素含量下降更显著、SOD、POD、CAT等抗氧化酶含量以及HO的积累上升更显著。表明osbrp1突变体对盐胁迫更敏感,说明该基因在盐胁迫的适应性中起着重要作用。该研究结果为下一步探究Os BRP1在盐胁迫中的响应机制奠定了基础。（5）过表达植株的获得及表达分析构建了具有由Ubiqutin基因强启动子驱动的Os BRP1-1300s GFP过表达重组载体,遗传转化获得了42株Os BRP1-GFP过量表达的植株;通过q RT-PCR方法和Western blotting分析,筛选出多个表达高的株系,为后续研究Os BRP1基因的功能提供实验材料。（6）与TBP蛋白的互作分析为了确定Os BRP1是否是通用转录因子,还是已经进化成特异性转录因子,利用酵母双杂交实验对Os BRP1与Os TBP蛋白的互作进行了分析。根据营养缺陷型选择性培养基生长情况,发现Os TBP没有自激活现象,并且与Os TBP没有互作。双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）实验也没有发现Os BRP1于Os TBP互作。这些结果表明Os BRP1可能已经不再作为通用转录因子,而是已经进化为具有特异功能的转录因子,在盐胁迫响应等方面发挥特定的功能。

关键词： TFIIB家族 OsBRP1 CRISPR/Cas9 盐胁迫生殖生长系统表达模式亚细胞定位

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