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灰树花UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1的克隆表达与功能研究

灰树花UDP葡萄糖基转移酶GFUGT88A1的克隆表达与功能研究

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作者：梁英英江苏大学

学位级别：硕士

UDP-糖基转移酶(Uridine Diphosphate-Glycosyltransferases,UGTs)普遍存在于动物、植物、真菌和细菌中。迄今为止,源自植物、细菌和动物的UGTs已在天然产物糖基化、抗生素合成、细菌糖基转移酶抑制剂的开发、动物炎症和神经系统等方面... 详细信息

UDP-糖基转移酶(Uridine Diphosphate-Glycosyltransferases,UGTs)普遍存在于动物、植物、真菌和细菌中。迄今为止,源自植物、细菌和动物的UGTs已在天然产物糖基化、抗生素合成、细菌糖基转移酶抑制剂的开发、动物炎症和神经系统等方面研究广泛,其功能和催化机制也得到较为深入的探索。尽管真菌作为多种化合物糖基化的全细胞催化剂具有巨大的潜力,但目前仅有少数几种真菌UGTs得到分离和表征。因此,为系统研究真菌UGTs的编码基因、酶学性质、底物特异性、区域选择性、催化效率以及催化机理,尤其对于食药用真菌来源的UGTs的研究,本论文首次以食用真菌灰树花为研究对象,挖掘、克隆得到灰树花UDP-葡萄糖基转移酶基因gfugt88a1,对其进行全面的生物信息学分析;其次,通过构建异源表达质粒,诱导表达和分离纯化得到了来自灰树花的重组UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1,系统地研究了该重组酶的体外催化活性以及酶学性质分析;最后,对催化反应产物进行分析,并基于同源建模和分子对接等技术手段,探究了可能影响GFUGT88A1催化功能和活性的关键氨基酸位点,初步阐明UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1延伸糖链的催化机理。所得的主要结论如下:(1)灰树花UDP-葡萄糖基转移酶基因gfugt88a1基因的克隆测序及生物信息学分析。其g DNA序列全长1951 bp,c DNA序列全长1389 bp,该基因共编码462个氨基酸,理论相对分子质量为50.96 k Da,该酶表现为亲水性,不存在信号肽及跨膜区。氨基酸序列中含有4个典型的保守结构域及6个TDP-binding位点,其属于GT1家族,表现为GT-B折叠。结合系统发育树及多序列比对信息,可知灰树花UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1与白腐菌Obba rivulosa的7个UGTs形成一个分支,并且来自于不同担子菌的相似序列之间同源性较低(～50%),但其C端保守结构域保持高度相似性,包含着一个典型的高度保守的特征性序列。(2)灰树花UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1的表达纯化、活性分析及酶学性质研究。构建了UDP-葡萄糖基转移酶基因gfugt88a1的原核表达载体p ET-30a-gfugt88a1,IPTG低温诱导表达得到目的产物,通过超声破碎菌体,变性处理,亲和层析,透析,超滤浓缩得到单一的重组GFUGT88A1,蛋白回收率为16.05%,酶的比活力达到53.02 U·μg;通过LC-MS/MS证实GFUGT88A1的相对分子质量为51.758 KDa,等电点为5.92;重组UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1的体外酶活分析表明GFUGT88A1对不同类型的小分子化合物及单/寡糖作为底物受体均表现出一定的催化活性,具有显著的底物宽泛性及较高的催化效率,对GFUGT88A1以寡糖作为受体底物进行的酶动力学分析表明,GFUGT88A1对昆布九糖(LAM-9)的亲和力最大,催化效率最高,推断LAM-9为GFUGT88A1的优选受体底物;酶学特性的研究表明,GFUGT88A1的最适反应p H和温度分别为7.0和37°C,并表现出良好的热稳定性和良好的p H稳定性,金属离子Fe、Fe 、Cu、Zn能够将GFUGT88A1的相对活性降为40%,有着强烈的抑制作用,而Na对酶的催化活性有明显的促进作用,GFUGT88A1的相对酶活提升至120%。(3)初步探究了灰树花UDP-葡萄糖基转移酶GFUGT88A1以寡糖作为受体底物的催化机制。重组酶GFUGT88A1对LAM-2,LAM-6和LAM-9都有一定的催化活性。HPLC-ELSD测定结果表明,以LAM-2作为受体底物时,36 h和48 h反应条件下,观察到DP值为4的新合成的低聚糖;当以LAM-6作为受体底物时,出现了DP值为8的新产物峰;以LAM-9作为受体底物时,合成的寡糖的保留时间为10.99 min,DP值为15;基于同源建模和分子对接等技术手段,证实GFUGT88A1包含两个独立的灵活连接的Rossmann结构域(β/α/β)组成的三维结构;通过SAVES和Pro SA进行构象合理性及残基间能量的评估,表明其为高质量模型;进而探究了可能影响GFUGT88A1催化功能和活性的关键氨基酸位点,在对GFUGT88A1与受体、供体分子相互作用分析中发现,Trp323对于识别和结合UDP-Glc作为供体具有重要作用;Glu349对受体底物的糖部分的识别以及将糖定位在糖基化反应的最适方向上十分重要。

关键词：灰树花 UDP-葡萄糖基转移酶异源表达糖链延伸分子对接

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