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狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化

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中国人兽共患病学报 2012年第9期28卷 932-937页

作者：鞠美芳殷相平柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室兰州730046

目的有效检测狂犬病毒抗原。方法本研究利用生物信息学软件对狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区进行分析,采用密码子优化策略将该序列的大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子。将优化的序列合成与表达载体pET-28a(+)分别双酶切、胶回... 详细信息

目的有效检测狂犬病毒抗原。方法本研究利用生物信息学软件对狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区进行分析,采用密码子优化策略将该序列的大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子。将优化的序列合成与表达载体pET-28a(+)分别双酶切、胶回收后连接并转化至Rosetta(DE3)菌株。挑选阳性重组表达菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。同时对最佳表达条件进行了研究,重组菌在30℃、IPTG终浓度为0.6mmol/L、诱导表达6h时重组蛋白的表达量达到最大值。结果狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区通过密码子优化后能够在大肠杆菌中成功表达,表达产物具有良好的反应原性。结论该项研究为后续检测狂犬病毒抗原的ELISA试剂盒的研发建立基础。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化原核表达

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

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中国兽医科学 2006年第6期36卷 449-453页

作者：蔡月琴叶菊秀李玲燕周继勇浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310029

为获得狂犬病病毒(RV)糖蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因,将其克隆于pMD18-T载体,再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因,将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)、pET-32a(+)和pGEX-4T-1... 详细信息

为获得狂犬病病毒(RV)糖蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因,将其克隆于pMD18-T载体,再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因,将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)、pET-32a(+)和pGEX-4T-1中,经PCR 和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21 (DE3)中进行表达,结果显示,克隆到pET-32a(+)的糖蛋白膜外区基因表达量最高,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测,不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应,表明,重组蛋白具有良好的反应原性。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白膜外区高效表达

狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化

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生物技术通报 2012年第9期28卷 114-119页

作者：鞠美芳殷相平柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室兰州730046

旨在有效检测狂犬病毒抗原及抗体。以狂犬病病毒aG株为模板,反转录扩增糖蛋白膜外区基因,并进行序列测定。将目的片段与表达载体pET-32a(+)分别双酶切、胶回收后相连并转化至Rosseta(DE3)菌株。选取阳性克隆经IPTG诱导表达后,进行SDS-P... 详细信息

旨在有效检测狂犬病毒抗原及抗体。以狂犬病病毒aG株为模板,反转录扩增糖蛋白膜外区基因,并进行序列测定。将目的片段与表达载体pET-32a(+)分别双酶切、胶回收后相连并转化至Rosseta(DE3)菌株。选取阳性克隆经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting及质谱鉴定。结果显示,在大肠杆菌中成功表达了糖蛋白膜外区。本研究为建立检测狂犬病毒抗原及抗体的ELISA诊断方法奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白膜外区原核表达

狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组基因的表达与鉴定

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中国病原生物学杂志 2015年第8期10卷 677-680页

作者：路静付玉荣伊正君潍坊医学院医学检验学系山东潍坊261053 潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室

目的构建狂犬病病毒糖蛋白外膜区基因质粒并在大肠埃希菌中表达,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定基础。方法采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区基因,目的片段与表达载体PET32a(+)分别经双酶切、胶回收后连接并转化至***... 详细信息

目的构建狂犬病病毒糖蛋白外膜区基因质粒并在大肠埃希菌中表达,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定基础。方法采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区基因,目的片段与表达载体PET32a(+)分别经双酶切、胶回收后连接并转化至*** BL21(DE3)菌株。阳性重组菌经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析后进行纯化,利用Western blot鉴定其反应原性。结果以狂犬病病毒CTN株为模板扩增的糖蛋白膜外区基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 323bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定后转化入*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达的融合蛋白分子质量单位大小约为66.6ku,与理论值相符;重组菌在IPTG终浓度为1mmol/L,诱导时间为4h,温度为37℃时蛋白表达产量最高。该融合蛋白主要以包涵体形式存在,可被His标签抗体识别。结论成功表达了狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白,该蛋白反应原性良好,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因克隆原核表达

狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备

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狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备

作者：鞠美芳中国农业科学院

学位级别：硕士

狂犬病又称恐水病，是急性、烈性、自然疫源性人兽共患传染病，其病原体是狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)。目前狂犬病仍然在世界多个国家和地区广泛流行，主要发生在亚洲和非洲的一些发展中国家，我国也是狂犬病的高发区，连续8年狂... 详细信息

狂犬病又称恐水病，是急性、烈性、自然疫源性人兽共患传染病，其病原体是狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)。目前狂犬病仍然在世界多个国家和地区广泛流行，主要发生在亚洲和非洲的一些发展中国家，我国也是狂犬病的高发区，连续8年狂犬病人报告病死数一直居我国37种法定报告传染病之首。单克隆抗体的诊断方法灵敏性高、特异性强、操作简单、价格低廉，所以在临床上很多疾病的检测和治疗中得到广泛应用。本研究利用单克隆抗体制备技术，以狂犬病毒aG株为研究材料，通过基因克隆、序列分析、密码子优化、原核表达、蛋白纯化以及单克隆抗体的制备，为建立检测狂犬病毒抗原和抗体的ELISA检测试剂盒奠定基础。本文首先从狂犬病毒aG株组织毒中成功克隆出糖蛋白膜外区片段，测序结果显示糖蛋白膜外区长1317bp，编码440个氨基酸。测序结果用NCBI中的blast软件比对分析，与GenBank中4aG株、PG株、中国疫苗株、334株的核苷酸序列相似性在99%以上，与国际标准攻毒株（CVS）的核苷酸序列相似性为93%，与日本犬用疫苗株Nishigahara株的核苷酸序列相似性为97%。由于外源基因在大肠杆菌中表达时，可能含有大肠杆菌的转录终止信号，所以本研究用稀有密码子计算器（RACC）分析目的片段，将序列中39组大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子，然后合成基因并与原核表达载体pET-28a(+)连接，转化到表达菌Rosseta（DE3）后进行IPTG诱导表达。研究表明，重组菌在30℃IPTG终浓度为0.6mM，诱导6h后，重组蛋白表达量最多。Western boltting检测证明表达产物具有较好的反应原性。用默克公司的His·Tag蛋白亲和层析纯化重组蛋白。间接ELISA法确定了检测犬RV抗体的抗原最佳包被量是1.725μg/mL，血清的最佳稀释度为1:200，HRP标记的二抗的稀释度为1:50000。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂乳化，免疫Balb/c小鼠3次，然后用重组蛋白加强免疫1次，取免疫小白鼠的脾细胞与sp2/0细胞融合后经过三次亚克隆和间接ELISA实验进行筛选，最终获得两株稳定分泌阳性单抗的杂交瘤细胞株(4B7和1F10）。ELISA实验证明，2株杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型分别为lgG2b和IgM;杂交瘤细胞的染色体数目分别约为95和103条;纯化后腹水效价均为1：25600;McAb特异性良好，有较高的稳定性;为后续RV抗原检测试剂盒的研发做好铺垫。

关键词：狂犬病毒糖蛋白膜外区原核表达间接ELISA 单克隆抗体