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桧状青霉GH61基因对植物木质纤维素降解的功能研究

桧状青霉GH61基因对植物木质纤维素降解的功能研究

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作者：白雪西北师范大学

学位级别：硕士

木质纤维素在自然界中的储量十分丰富,是植物生物质最主要的组成成分,其资源化利用可获得生物乙醇等液体燃料和化工产品。发展生物质能源不仅有助于保护环境、减缓石油消耗,对我国能源问题的解决及农业产业链的延伸都起到了重要的支撑... 详细信息

木质纤维素在自然界中的储量十分丰富,是植物生物质最主要的组成成分,其资源化利用可获得生物乙醇等液体燃料和化工产品。发展生物质能源不仅有助于保护环境、减缓石油消耗,对我国能源问题的解决及农业产业链的延伸都起到了重要的支撑作用。目前木质纤维素酶的生产应用主要依靠丝状真菌胞外分泌的酶系,然而由于化学成分及结构复杂等多种因素,其降解酶系的生产成本高且水解活性低,制约了木质纤维素的有效利用和开发,因此高效的木质纤维素水解酶系的生产依然是木质纤维素资源利用的瓶颈,协同传统纤维素酶系进行纤维素水解的有关蛋白也逐渐成为该领域的研究热点。糖苷水解酶61家族是一类在纤维水解真菌中广泛存在、能够显著提高纤维素酶系对底物水解作用的蛋白酶,并且是唯一的Cu2+依赖的氧化酶家族,它对于纤维素底物的作用本质为氧化过程,目前GH61家族蛋白酶的研究已经成为纤维素酶领域的研究热点之一。桧状青霉是本实验室前期工作中筛选到的1株产纤维素酶的青霉属菌,通过基因组测序及比较基因组学分析,发现桧状青霉的基因组大小为27.25Mbp,共预测到8591个编码基因;KOG与GO的功能注释结果表明桧状青霉的次级代谢产物代谢及分泌的功能较为发达;通过水解酶的注释发现桧状青霉的纤维素水解酶系较为均衡,有较多的半纤维素酶编码基因,并发现了一个GH61基因,是很好的产纤维素酶研究菌种。为了更好的研究桧状青霉纤维素酶基因的调控及表达机制,建立了根癌农杆菌介导的桧状青霉遗传转化体系,优化后的桧状青霉ATMT法实验条件为:桧状青霉孢子悬液浓度106 cfu/m L,农杆菌菌液OD600值0.6左右,以等体积混合,于含有200μmol/L诱导剂乙酰丁香酮的AIM平板上共培养,共培养温度22℃,共培养时间48h。实验证明在该条件下得到的转化子数量最多,且具有较好的遗传稳定性。通过构建桧状青霉GH61基因敲除盒,采用优化后的农杆菌介导遗传转化法成功敲除了桧状青霉基因组的GH61基因,并研究了该基因的生物学功能。对桧状青霉野生株与GH61基因敲除株的表型分析及生长速率的比较发现,GH61基因的敲除对桧状青霉的菌株生长仅有较小的负面影响,胞外蛋白浓度和纤维素酶活力也是略有降低。在添加有等量FPA胞外酶液的20m L水解体系中,GH61基因敲除株对1%气爆玉米秸秆底物的水解能力也要低于桧状青霉野生株,水解72h后的水解率与野生株相比降低了17.5%。对桧状青霉的GH61基因进行扩增,构建了GH61基因表达盒并在黑曲霉中成功进行了异源表达,得到了2株重组株。通过对黑曲霉野生株与GH61重组株的酶活测定,比较结果发现重组株的滤纸酶活及β-葡萄糖苷酶酶活与黑曲霉野生株相比均有相应提高;添加等量FPA胞外酶液的20m L水解实验结果也表明,水解72h后GH61重组株的水解率与野生株相比分别提高了9.8%和12.1%。

关键词：桧状青霉糖苷水解酶家族61 农杆菌介导的遗传转化基因敲除异源表达

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