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作者：施文婷广东药科大学

学位级别：硕士

本文以益智(Alpinia oxyphylla Miq.)糖聚物为研究对象,深入考察其体内抗阿尔茨海默病活性,进一步分离纯化益智粗糖聚物得到均一糖聚物,并对其进行结构鉴定。通过水提醇沉和碱提醇沉两种方法得到益智的四种粗糖聚物AO50、AO70、AO90和AO... 详细信息

本文以益智(Alpinia oxyphylla Miq.)糖聚物为研究对象,深入考察其体内抗阿尔茨海默病活性,进一步分离纯化益智粗糖聚物得到均一糖聚物,并对其进行结构鉴定。通过水提醇沉和碱提醇沉两种方法得到益智的四种粗糖聚物AO50、AO70、AO90和AOB。通过腹腔注射1 mg/kg氢溴酸东莨菪碱成功构建阿尔茨海默病(AD)小鼠模型。应用行为学实验评价益智粗糖聚物对AD模型小鼠学习记忆能力以及焦虑行为的影响。结果表明益智粗糖聚物(500mg/kg)显著提高AD小鼠的学习记忆能力,改善其焦虑行为,并且与阳性药石杉碱甲(2 mg/kg)相比,无显著性差异。在生化指标检测中,益智粗糖聚物显著降低AD小鼠脑组织和血清中NO、IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE-2的水平;提高小鼠体内GSH和SOD的水平;降低MDA水平。表明益智粗糖聚物可能通过调节炎症因子和氧化应激因子的表达发挥抗阿尔茨海默病的作用。利用气-质联用技术进行代谢组学研究,结果表明益智糖聚物AO50、AO70、AO90和AOB可调节AD小鼠的生物标志物含量,即调节其代谢物水平趋近于正常组,进一步表明益智粗糖聚物具有显著的抗阿尔茨海默病活性。基于益智粗糖聚物良好的体内抗阿尔茨海默病活性,对益智粗糖聚物AO50、AO70和AO90分别进行脱蛋白、透析和冻干,再运用DEAE-Cellulose 52和Sephadex G-75柱层析对其进行分离纯化,得到七个均一糖聚物AOP50-2-1、AOP70-1、AOP70-2-1、AOP70-2-2、AOP70-3-1、AOP70-3-2和AOP90-2。比旋光度法和HPGPC法检测结果显示其均为均一糖聚物,相对分子量分别为72.45 kDa、5.33 kDa、76.66 kDa、16.53 kDa、36.85 kDa、12.20 kDa和1.83 kDa。通过PMP柱前衍生化-HPLC法测定其单糖组成,完全甲基化-GC-MS测定其糖残基种类和比例,再结合1D和2D NMR技术分析各糖残基的连接位点,对七个均一糖聚物的结构分别进行鉴定。结果表明AOP50-2-1、AOP70-1、AOP70-2-1、AOP70-2-2、AOP70-3-1、AOP70-3-2和AOP90-2均为酸性杂多糖,AOP70-1表面有不规则的圆形凹陷,且粗糙有网状纹理;AOP70-2-1呈不规则片状结构,表面有粗糙的褶皱;AOP70-2-2呈不规则片状,表面比较平滑;AOP70-3-1呈多片层堆积而成的疏松立体结构;AOP70-3-2呈细丝状结构,分布零散,表面粗糙有褶皱;AOP90-2呈碎屑状结构,其表面有孔状凹陷。七个益智均一糖聚物结构均未见文献报道。

关键词：益智糖聚物结构鉴定抗阿尔茨海默病抗神经炎

狗脊糖聚物的分离纯化、结构鉴定及抗骨质疏松活性研究

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狗脊糖聚物的分离纯化、结构鉴定及抗骨质疏松活性研究

作者：黄冬广东药科大学

学位级别：硕士

本论文对狗脊(Cibotium barometz)粗糖聚物的体内抗骨质疏松活性进行深入研究。同时对狗脊粗糖聚物进行分离纯化,对获得的均一糖聚物进行结构鉴定。狗脊中的水溶性糖聚物采用经典水提分级醇沉法进行提取,获得三个部位的粗糖聚物分别命名... 详细信息

本论文对狗脊(Cibotium barometz)粗糖聚物的体内抗骨质疏松活性进行深入研究。同时对狗脊粗糖聚物进行分离纯化,对获得的均一糖聚物进行结构鉴定。狗脊中的水溶性糖聚物采用经典水提分级醇沉法进行提取,获得三个部位的粗糖聚物分别命名为CB50、CB70和CB90,而水提残渣则用稀碱液浸提,醇沉,得到碱溶性粗糖聚物CBB。本课题组前期体内抗骨质疏松实验结果表明四个部位狗脊粗糖聚物均展现了良好的抗骨质疏松效果。由于CBB的抗骨质疏松效果尤为显著,因此本实验对CBB组大鼠股骨干骺端和腰椎骨进行进一步Micro-CT扫描和三维重建分析,结果显示CBB能够显著增加骨质疏松大鼠股骨骨小梁数量和厚度,降低骨小梁分离度,改善结构模型指数使其由棒状向板状结构转变,说明狗脊碱提粗糖聚物可以显著改善去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨干骺端松质骨的骨微结构。基于狗脊粗糖聚物良好的体内抗骨质疏松活性,本实验对狗脊四个部位粗糖聚物CBB、CB50、CB70和CB90进行分离纯化、结构鉴定,并明确其具有抗骨质疏松活性的均一糖聚物成分。首先对各部位糖聚物分别进行脱蛋白、透析和冻干,然后分别经DEAE-Cellulose 52层析柱进行初步分离,再分别经Sephadex G-75凝胶柱进一步纯化,得到五个糖聚物样品CBBP-1、CBBP-2、CBBP-3、CBP70-1-1和CBP70-1-2。经紫外可见光谱扫描表明其均不含有蛋白质和核酸;经比旋光度法和高效凝胶渗透色谱法测定其均为均一糖聚物,分子量分别为1445 Da、10662 Da、122975 Da、12724 Da、3611 Da。采用PMP柱前衍生化-高效液相法分析其单糖组成,完全甲基化-GC-MS分析其糖残基组成,并结合核磁共振波谱分析其糖残基连接位点,获得其一级结构特征。其中CBBP-1为葡甘低聚糖,而CBBP-2、CBBP-3、CBP70-1-1和CBP70-1-2均为杂多糖。此外,这些均一多糖的高级结构则采用刚果红实验、圆二色谱和扫描电镜进行初步研究,刚果红实验和圆二色谱分析结果显示这些均一糖聚物均不含有三股螺旋结构。扫描电镜结果表明:CBBP-1为不规则的片状结构,其表面光滑且有球状突起;CBBP-2为交织在一起的木屑样薄片状,表面粗糙;CBBP-3呈现神经细胞样形态,且树突状分支末端有光滑的球状突起;CBP70-1-1为大小和形状都不规则的片状,其表面呈现尖锐的突起;CBP70-1-2也显示为不规则片状结构,其表面呈现平滑的起伏。这五个均一糖聚物均未见文献报道。

关键词：狗脊糖聚物分离纯化结构鉴定抗骨质疏松活性

两种补肾壮骨类中药中糖聚物的分离纯化、结构鉴定及抗骨质疏松活性评价

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两种补肾壮骨类中药中糖聚物的分离纯化、结构鉴定及抗骨质疏松活...

作者：张少杰广东药科大学

学位级别：硕士

本论文以怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume)和巴戟天(Morinda officinalis How)两种补肾壮骨类中药为研究对象,对分离纯化所得的均一糖聚物进行一级结构研究,初步考察其高级结构,并对其抗骨质疏松活性进行系统的评价。通过水提醇沉... 详细信息

本论文以怀牛膝(Achyranthes bidentata Blume)和巴戟天(Morinda officinalis How)两种补肾壮骨类中药为研究对象,对分离纯化所得的均一糖聚物进行一级结构研究,初步考察其高级结构,并对其抗骨质疏松活性进行系统的评价。通过水提醇沉法结合碱提醇沉法得到怀牛膝和巴戟天的3种粗糖聚物。依次利用离子交换柱层析和凝胶柱层析对粗糖聚物进行分离纯化,并结合各种波谱分析手段和一系列的化学方法对纯化所得的均一糖聚物进行一级结构解析。此外,利用糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型对精糖聚物进行抗骨质疏松活性评价。联合使用离子交换色谱柱DEAE-52和凝胶色谱柱Sephacryl S-100对粗糖聚物ABPB、MO50、MOPB进行系统的分离纯化,最终得到6个精糖聚物,分别为ABPB-1、ABPB-2、ABPB-3、MOW50-1、MOP50-2、MOPB-2。比旋光度法和高效凝胶渗透色谱(HPGPC)结果显示6个糖聚物均为均一糖聚物,其分子量分别为2319 Da、25680Da、77231 Da、1810 Da、2503 Da、94994 Da。通过完全酸水解,结合高效液相色谱(HPLC)和离子色谱对6个均一糖聚物进行单糖组成分析,综合单糖组成、红外光谱、GC-MS、NMR分析结果对6个均一糖聚物进行一级结构鉴定,结果表明MOW50-1和MOP50-2均为菊淀粉型果聚糖,而ABPB-1为混合型果聚糖。ABPB-2、ABPB-3和MOPB-2均为酸性杂多糖。通过刚果红实验、圆二色谱、扫描电镜分别对6个均一糖聚物的高级结构进行初步考察,结果显示6个均一糖聚物均不存在三股螺旋结构,且在扫描电镜观察下呈现不同的形态,这可能与其分子量、单糖组成等基本结构特征的不同有关。目前,国内外相关文献中均未见此6个均一糖聚物的结构报道。利用糖皮质激素泼尼松龙对受精后3天(3-dpf)的斑马鱼幼鱼进行诱导,成功建立斑马鱼骨质疏松模型。以斑马鱼幼鱼头部骨骼的相对荧光强度为检测指标,对ABPB-3和ABW50-1的抗骨质疏松活性进行系统的评价。结果显示怀牛膝精糖聚物ABW50-1和ABPB-3均能显著提高模型斑马鱼幼鱼头骨的相对荧光强度,活性具有浓度依赖性,且未显示出毒性,说明ABPB-3及ABW50-1对糖皮质激素诱导的骨质疏松症具有良好的治疗效果。

关键词：怀牛膝巴戟天糖聚物结构鉴定抗骨质疏松

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黄精糖聚物的提取、分离纯化和结构鉴定

黄精糖聚物的提取、分离纯化和结构鉴定

作者：刘基广东药科大学

学位级别：硕士

黄精(Polygonatum sibiricum Red.)是一种药食两用的传统中药,具有多种生物活性。本论文对黄精根茎进行分离纯化得到均一糖聚物,并对其结构进行解析,为黄精糖聚物抗骨质疏松的作用机制和构效关系研究提供数据支撑。首先利用热水和碱液... 详细信息

黄精(Polygonatum sibiricum Red.)是一种药食两用的传统中药,具有多种生物活性。本论文对黄精根茎进行分离纯化得到均一糖聚物,并对其结构进行解析,为黄精糖聚物抗骨质疏松的作用机制和构效关系研究提供数据支撑。首先利用热水和碱液依次对黄精根茎进行提取,之后通过分级醇沉得到黄精三个部位的粗多糖,即PS50、PS90和PSB,使用苯酚硫酸法测定糖含量分别为:56.77%、70.64%和48.45%。分别用Sevage法对粗多糖PS50、PS90和PSB进行脱蛋白,随后进行透析、浓缩、冻干处理。通过离子交换色谱柱(DEAE-Cellulose 52)和凝胶色谱柱(Sephacryl S-100)对样品进行分离纯化,从而获得8个黄精糖聚物,分别为:PSP90-1、PSP90-2、PSP50-2-1、PSP50-2-2、PSP50-3、PSBP-2-1、PSBP-2-2和PSBP-3。利用比旋光度法和高效凝胶渗透色谱法对8个黄精糖聚物进行纯度验证,结果表明这8个糖聚物都是均一糖聚物,分子量分别为1.2 k Da、1.6 k Da、7.8 k Da、7.1 k Da、17.0 k Da、40.3 k Da、12.2 k Da和10.3 k Da。利用了离子色谱法和PMP柱前衍生化-高效液相色谱法分析糖聚物的单糖组成,再结合红外分析、完全甲基化-GC-MS分析和NMR分析得到这8个糖聚物的一级结构,结果表明PSP90-1、PSP90-2、PSP50-2-1、PSP50-2-2、PSP50-3、PSBP-2-1、PSBP-2-2和PSBP-3均为杂多糖,且其结构均未见报道。采用刚果红实验和扫描电镜分析上述8个糖聚物的高级结构,结果表明它们均没有三股螺旋结构,且在扫描电镜下其表面形貌各不相同。对获得的8个均一糖聚物进行体外促成骨活性评价,结果表明黄精糖聚物PSP90-1、PSP90-2和PSP50-2-2具有一定的体外促进骨形成活性。

关键词：黄精糖聚物提取纯化结构表征

六种植物中糖聚物的体外促成骨活性及作用机制研究

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六种植物中糖聚物的体外促成骨活性及作用机制研究

作者：李天钰广东药科大学

学位级别：硕士

研究表明天然产物和生物活性物质促进骨形成是治疗骨质疏松症的有效途径之一。课题组前期从啤酒花(Humulus lupulus,HL)、牛膝(Achyranthes bidentata,AB)、黄精(Polygonatum sibiricum,PS)、骆驼刺(Alhagi pseudlhagi,AP)、巴戟天(Morinda officinalis,MO)和仙茅(Curculigo orchioides,CO)中纯化得到20个精糖聚物,本论文对其进行体外促成骨活性评价,并对活性较好的牛膝精糖聚物ABW90-1和巴戟天精糖聚物MOPB-2进行促成骨作用机制的研究。将课题组前期分得的6个来源于啤酒花(HLP50-1、HLP70-2-1、HLP70-2-2、HLP70-3、HLBP-2和HLBP-4)、2个来源于怀牛膝(ABPB-4和ABW90-1)、3个来源于黄精(PSP90-1、PSP90-2和PSP50-2-2)、6个来源于骆驼刺(APP70-3-1、APP90-1-1、APP90-1-2、APP90-2、APBP-2-2和APBP-2-3)、2个来源于巴戟天(MOW50-1和MOPB-2)以及1个来源于仙茅(COP50-4)的共20个糖精聚物分别作用于MC3T3-E1细胞,借助MTT实验、ALP活性实验以及茜素红染色实验检测其对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。实验结果表明HLP50-1、HLP70-2-1、HLP70-2-2、HLP70-3、HLBP-2、HLBP-4、ABPB-4、PSP90-1、PSP90-2、APP90-2、APBP-2-2和MOPB-2等12个糖聚物均具有促进MC3T3-E1细胞增殖的作用;20个糖聚物在一定浓度下均可以提高MC3T3-E1细胞的ALP活性以及矿化能力,并且一定浓度的HLP50-1、HLP70-2-1、ABPB-4和MOPB-2对ALP活性和矿化的促进作用与E2相当,一定浓度的HLP70-2-2、ABW90-1和COP50-4对ALP活性和矿化的促进作用强于阳性药E2。以上结果表明这20个糖聚物均具有良好的体外促成骨活性,本课题结合活性结果及糖聚物实际累积量决定选取ABW90-1和MOPB-2用于后续机制研究。借助qRT-PCR、Western blot、分子对接以及免疫荧光等方法探究糖聚物ABW90-1和MOPB-2对成骨相关通路的影响。结果表明ABW90-1显著提高成骨相关基因、蛋白的表达量,如OPN、BMP2、RUNX2和OSX。分子对接实验结果显示ABW90-1与WNT通路复合物(-5.9394 kcal/mol)或BMP2(-5.9622 kcal/mol)之间具有较强的相互作用。此外,ABW90-1(25μM)通过促进active-β-catenin、p-GSK-3β、LEF-1、BMP2、p-SMAD1的表达以及β-catenin的核转位激活WNT/β-catenin、BMP2/SMAD1信号通路。同时,ABW90-1的促成骨作用能够被DKK-1(WNT通路特异性抑制剂)和Noggin(BMP通路特异性抑制剂)部分抑制。上述结果表明ABW90-1通过WNT/β-catenin与BMP2/SMAD1信号通路发挥促成骨的作用。此外研究发现MOPB-2通过显著上调BMP2和p-SMAD1的表达量激活BMP2/SMAD1通路。LDN-193189(BMP通路抑制剂)能够显著抑制MOPB-2对于增殖、分化、矿化以及成骨相关基因、蛋白表达水平的促进作用,进一步证实MOPB-2通过BMP2/SMAD1通路发挥促成骨的作用。综上,本论文初步阐明了啤酒花、牛膝、黄精、骆驼刺、巴戟天和仙茅促成骨作用的活性部位及成分。系统阐述了ABW90-1通过WNT/β-catenin与BMP2/SMAD1信号通路发挥促进成骨分化的机制;MOPB-2通过BMP2/SMAD1通路发挥促成骨作用的机制。

关键词：骨质疏松症糖聚物成骨分化作用机制信号通路

雪菊糖聚物的分离纯化、结构鉴定及药理活性研究

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雪菊糖聚物的分离纯化、结构鉴定及药理活性研究

作者：陈威广东药科大学

学位级别：硕士

本文以雪菊(Coreopsis tinctoria Nutt)糖聚物为研究对象,对其进行提取、分离纯化、结构鉴定和药理活性研究。首先采用热水和碱液对雪菊中的糖聚物进行提取,对水提液进行分级醇沉,得到三个部位的粗糖聚物P50、P70、P90,碱提取液醇沉得... 详细信息

本文以雪菊(Coreopsis tinctoria Nutt)糖聚物为研究对象,对其进行提取、分离纯化、结构鉴定和药理活性研究。首先采用热水和碱液对雪菊中的糖聚物进行提取,对水提液进行分级醇沉,得到三个部位的粗糖聚物P50、P70、P90,碱提取液醇沉得到粗糖聚物PB。采用苯酚-硫酸法测得四个部位糖聚物的糖含量分别为:66.60%、54.41%、80.78%、50.68%。将溶解性较好且糖含量高的50和70部位粗糖聚物进行脱蛋白、透析,然后用DEAE-Cellulose 52柱进行分离,再用Sephacryl S-100或Sephadex G-75进一步纯化,得到五个糖聚物CT50-2、CT70-1、CT70-1A、CT70-1B和CT70-3。采用高效凝胶渗透色谱法和比旋光度进行纯度验证,结果表明它们都为均一糖聚物,且比旋光度[a] 分别是-12°、-45°、-9°、-37°、-20°。CT50-2、CT70-1和CT70-3相对分子量经高效凝胶渗透色谱法计算分别是10012、2100 Da和1247 Da,CT70-1A和CT70-1B经MALDI-TOF-MS测得的分子量分别是1221Da和1318 Da。经单糖组成、红外光谱、甲基化/GC-MS和核磁共振图谱分析等方法得到五个糖聚物的一级结构,结果表明,CT50-2含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5种单糖,包括→α-D-Glcp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(1→、α-L-Araf-(1→、→2)-α-L-Araf-(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→、→6)-β-D-Galp(1→和→3,6)-β-D-Manp-(1→七种连接残基;CT70-1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和果糖等6种单糖组成,包括→1)-α-D-Glcp、→4)-Glcp-α-D-(1→、→1)-α-L-Araf、→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→3)-β-D-Manp-(1→、→,6)-β-D-Manp-(1→和→2,6)-β-D-Fruf-(1→十种连接残基;而CT70-1A、CT70-1B和CT70-3均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,其中,CT70-1A含有α-D-Glcp-(1→、→6)α-D-Glc-(1→、→2)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Manp-(1→五种连接残基,CT70-1B含有α-D-Glcp-(1→、→2,3,6)-α-D-Glcp-(1→、→2)-α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Manp-(1→六种连接残基,CT70-3含有→1)-α-D-Glcp、→4)-α-D-Glcp-(1→、→1)-α-L-Araf、→6)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Manp-(1→五种连接残基。扫描电镜结果表明CT70-1不规则的形状,表面分布着细小不均匀的颗粒,CT70-3为不规则碎片,圆二色谱结果表明CT70-1和CT70-3均不含三股螺旋结构。这五个结构均未见报道。考察各糖聚物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性,探讨雪菊糖聚物的降血糖活性。结果表明各糖聚物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有不同程度的抑制作用,CT50-2、CT70-1、CT70-1A、CT70-1B和CT70-3对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC分别是1.79±0.10、3.00±0.17、2.14±0.10、2.12±0.06和4.89±0.02 mM;CT50-2、CT70-1、CT70-1A、CT70-1B和CT70-3对α-淀粉酶抑制活性的IC分别是1.80±0.10、2.79±0.02、2.77±0.10、2.75±0.06和3.35±0.03 mM。检测雪菊糖聚物对RAW264.7细胞活力及产生NO量的影响,结果表明CT70-1能显著性抑制RAW264.7细胞产生NO的量,且IC为0.07 mM。检测雪菊糖聚物对BV2活力及产生NO量的影响,结果表明CT70-1、CT70-1A、CT70-1B和CT70-3均能抑制BV2细胞产生NO,IC值分别是0.12、0.23、0.24和0.27 mM,说明雪菊糖聚物CT70-1、CT70-1A、CT70-1B和CT70-3可通过抑制BV2细胞活性来发挥抗神经炎的作用。

关键词：雪菊糖聚物分离纯化结构鉴定活性研究

基于表面引发的生物模板单体适配聚合法制备特异性聚合物

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基于表面引发的生物模板单体适配聚合法制备特异性聚合物

作者：马晓亮苏州大学

学位级别：硕士

特异性识别是体内一个非常重要的过程,包括物质运输、信号传递、免疫调节等,对探索和了解人体的运行机制,特别是对各种疾病的研究具有重要意义。特异性识别在体外的应用需求巨大,如酶联免疫吸附测试、传感器、体内应用、药物递送、癌症... 详细信息

特异性识别是体内一个非常重要的过程,包括物质运输、信号传递、免疫调节等,对探索和了解人体的运行机制,特别是对各种疾病的研究具有重要意义。特异性识别在体外的应用需求巨大,如酶联免疫吸附测试、传感器、体内应用、药物递送、癌症诊断与治疗等。但是生物方法获得的特异性试剂,如抗体和核酸适配体等,制备复杂,储备要求高,对操作人员的专业要求高,因此,开发简便的合成方法制备化学稳定性高、易于储存的特异性试剂十分必要。本文针对细胞和蛋白两种生物模板,提出通用性策略——生物模板单体适配聚合法制备相应的特异性聚合物。考虑到生物模板的特殊性,基于表面引发的可逆失活自由基聚合(SI-RDRP),以生物相容性为标准,优化聚合方法。首先,我们以贴壁细胞为模板,建立细胞特异性含糖聚合物表面的制备方法,该制备方法具有通用性。我们探究了该含糖聚合物表面的特异性以及再生循环使用性能和特异性的来源;基于捕获细胞进行再分析的需求,探究温敏组分对细胞无损释放的可能性;探究温敏组分对特异性的影响。然后我们又以蛋白作为模板,建立蛋白特异性聚合物的制备方法。在不同pH条件下,蛋白质带电情况不同,我们选用pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为溶剂,选用合适的带电单体作为亲和单体,对于带正电的溶菌酶(Lysozyme)选用甲基丙烯酸(MAA),带负电的牛血清白蛋白(BSA)选用甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DMC),选用磺酸甜菜碱(MEDSA)为不亲和单体,共同构成聚合物,制备蛋白特异性聚合物,用模板蛋白和非模板蛋白探究聚合物的特异性;利用计算机模拟,对聚合物的特异性进行探究,深化对聚合物特异性产生原因的理解。具体研究内容如下:(一)通过细胞-糖单体-适配聚合法(cell-sugarmonomer-aptation-polymerization,CS-MAP),制备细胞特异性聚合物表面。首先,由于细胞模板缺乏坚固细胞壁保护,对聚合体系提出了生物相容性的要求,我们选用零价铁介导的可逆失活自由基聚合(Fe0SI-RDRP),不需要额外除氧,反应溶剂可以是PBS溶液,聚合过程不受溶剂影响。考虑到细胞与聚合物的分离问题,选用贴壁细胞。单体的选择上,选取与细胞亲和与不亲和的两种单体,共同构成聚合物。由于细胞表面具有许多特定糖结合蛋白,因此选用含糖单体,不亲和单体选用在特异性中至关重要的防污单体磺酸甜菜碱(MEDSA)。用上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性细胞)——小鼠成纤维细胞(L929)和EpCAM阴性细胞——人宫颈癌细胞(Hela)作为模板都得到了具有特异性的含糖聚合物表面,说明CS-MAP能适应不同类型的细胞。面对单一种类细胞和混合细胞,该含糖聚合物表面都表现出较好的特异性,并且可以循环使用。进一步的特异性来源探究发现特异性与表面上含糖聚合物的组成和链序有关。进一步将防污组分换成温敏组分,可以实现细胞的无损释放,另外,特异性依然存在,但是温度响应损害了一部分特异性。(二)通过蛋白-带电单体-适配聚合(protein-charged monomer-aptation-polymerization,PC-MAP)的方法制备蛋白特异性聚合物。对于蛋白模板聚合,我们选用具有良好的生物相容性的零价铜介导的可逆失活自由基聚合(Cu-RDRP),聚合条件温和,不会破坏蛋白活性,这通过圆二色谱和蛋白活性测试得到验证。我们选用pH=7.4的PBS缓冲溶液条件,该条件下利用带正电的Lysozyme和带负电的BSA作为模板均得到特异性聚合物,说明该聚合方法对带电蛋白具有通用性。所得的特异性聚合物具有良好的细胞相容性和血液相容性,特异性聚合物与模板蛋白和非模板蛋白的结合能力通过耗散型石英晶体微天平进行评估。进一步,通过计算模拟探究聚合物产生特异性原因,发现聚合物链序起着至关重要的作用。总之,本文基于SI-RDRP的生物模板单体适配聚合法,成功制备了对细胞和蛋白都有特异性的聚合物,并探究了特异性原因,为特异性聚合物的合成提供新思路。

关键词：表面引发的可逆失活自由基聚合(SI-RDRP) 特异性聚合物糖聚物生物模板-单体适配聚合

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浒苔多糖的分离、纯化及活性研究

浒苔多糖的分离、纯化及活性研究

作者：赵士峰东南大学

学位级别：硕士

本论文以浒苔(Enteromorpha prolifera)为研究对象,首先对浒苔的营养成分粗纤维、氨基酸及元素含量进行了分析,然后通过热水提取法和碱液提取法从浒苔中分别提取得到水提粗多糖WEP和碱提粗多糖AEP,利用DEAE-52 Cellulose和Sephadex G-10... 详细信息

本论文以浒苔(Enteromorpha prolifera)为研究对象,首先对浒苔的营养成分粗纤维、氨基酸及元素含量进行了分析,然后通过热水提取法和碱液提取法从浒苔中分别提取得到水提粗多糖WEP和碱提粗多糖AEP,利用DEAE-52 Cellulose和Sephadex G-100对两种粗糖聚物进行分离纯化,并结合红外(FT-IR)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、高效液相色谱(HPLC)、核磁(NMR)等技术手段对10个精糖聚物进行了一级结构解析,使用扫描电镜(SEM)观察精糖聚物表面形貌,刚果红实验对其高级结构进行了初步研究。论文同时利用DPPH自由基、超氧阴离子自由基(·O)和ABTS自由基清除实验评价了精糖聚物的体外抗氧化活性,采用MTT法对浒苔精糖聚物对MGC-803(人胃癌细胞)、Bel-7402(肝癌细胞)、T24(人膀胱癌细胞)、Hep G2(人肝癌细胞)的抑制活性进行了研究。水提粗糖聚物WEP经DEAE-52 Cellulose和Sephadex G-100分离纯化后得到6种精糖聚物,分别为PWEP-1、PWEP-2、PWEP-3、PWEP-4、PWEP-5和PWEP-6,针对分离得到的量较多的4种水提糖聚物进行了结构鉴定和药理活性研究。HPGPC结果显示4种水提精糖聚物(PWEP-1、PWEP-3、PWEP-5和PWEP-6)的分子量分别为4259 Da、186056 Da、225267 Da和136817 Da;碱提糖聚物AEP分离纯化后得到6种精糖聚物,分别为PAEP-1、PAEP-2、PAEP-3、PAEP-4、PAEP-5和PAEP-6,分子量分别为34377 Da、22905 Da、64151 Da、120062Da、48161 Da和105283 Da。HPLC结果显示PAEP-4和PAEP-5中鼠李糖含量最多,PWEP-6、PAEP-1、PAEP-2和PAEP-3中半乳糖醛酸含量最多,PWEP-5葡萄糖醛酸含量最多,PWEP-3葡萄糖含量最多,PAEP-6中木糖最多。单糖组成分析结果表明PAEP-5不含醛酸类单糖,为中性糖聚物,其余为酸性糖聚物。刚果红实验和扫描电镜对精糖聚物的高级结构初步研究,刚果红实验结果显示10种精糖聚物均不含有三股螺旋结构。扫描电镜下精糖聚物呈现不同的形态,这可能与提取方式、洗脱液的浓度以及分子量、单糖组成等因素有关。NMR结果显示PWEP-5中存在α-D-Glcp A、β-D-Glcp、α-D-Galp、α-D-Manp和α-D-Rhap残基;PAEP-2以→4)-α-Galp A-6-OMe-(1→为主链骨架,支链包含α-D-Manp-6-OMe-(1→、→3,5)-α-D-Araf-(1→和β-D-Glc A-(1→残基,是来自细胞壁的果胶糖;PAEP-4中具有α-L-Rhap-(1→骨架。利用DPPH、·O和ABTS自由基清除实验研究了精糖聚物的体外抗氧化活性,10种精糖聚物均表现出较好的抗氧化活性,且对三种自由基DPPH、·O和ABTS的清除能力展现出浓度依赖性关系,其中水提精糖聚物中,PWEP-5对DPPH、·O、和ABTS三种自由基的清除作用最明显,对三种自由基的清除率分别为57.27%、52.92%和66.53%;碱提精糖聚物中PAEP-1和PAEP-2对三种自由基的清除作用最强,PAEP-1对三种自由基的清除率分别为56.40%、54.27%和42.07%,PAEP-2对三种自由基的清除率为48.67%、52.92%和48.20%。体外抗氧化结果表明,分子量较低和糖醛酸含量较大的糖聚物糖聚物具有更强的抗氧化活性。MTT实验结果表明精糖聚物对人胃癌细胞(MGC-803)、肝癌细胞(Bel-7402)、人膀胱癌细胞(T24)和人肝癌细胞(Hep G2)的抑制率均低于50%,表明精糖聚物对肿瘤细胞不具有明显的抑制作用,与糖聚物中不含有三股螺旋结构有关。

关键词：浒苔糖聚物结构解析抗氧化活性抗肿瘤活性

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