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OsSGT2催化睾酮糖基多样化的探索及催化机制研究

OsSGT2催化睾酮糖基多样化的探索及催化机制研究

引用

作者：刘元宁北京协和医学院

学位级别：硕士

天然产物糖苷是新药发现的重要来源,作为这些天然药效团的关键元素,附着的糖通常对生物活性至关重要。糖基化反应是合成结构多样的糖苷的关键步骤,可以改善天然药物的理化性质、药理活性以及生物利用度。因此,糖基化修饰正在发展成为创... 详细信息

天然产物糖苷是新药发现的重要来源,作为这些天然药效团的关键元素,附着的糖通常对生物活性至关重要。糖基化反应是合成结构多样的糖苷的关键步骤,可以改善天然药物的理化性质、药理活性以及生物利用度。因此,糖基化修饰正在发展成为创建生物活性小分子糖苷库的最重要的催化工具之一,但是仍有许多问题尚待解决,比如糖苷的化学合成需要糖基活化,涉及多个保护/去保护步骤来控制区域选择性,这往往会提高产品成本。因此,挖掘一种绿色高效的糖基多样化工具成为本领域的研究热点。糖基转移酶（UGTs）是一类超家族酶,它通过将糖基从UDP-糖（糖基供体）转移到底物（糖基受体）来催化糖基化反应,以绿色高效的方式合成糖苷类化合物,反应过程具有高效性和立体/区域选择性,。课题组前期的化学成分研究表明,桑多斯虎眼万年青植物中含有大量的甾体糖苷类化合物,推测该植物中具有参与糖苷产物生物合成的糖基转移酶。本研究通过转录组分析和基因挖掘,从桑多斯虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae）中鉴定出具有催化睾酮糖基多样化能力的糖基转移酶OsSGT2。本文主要围绕OsSGT2的催化功能、酶学性质对睾酮糖苷的生物合成进行了研究,并通过理性设计提高了OsSGT2对睾酮-N-乙酰葡萄糖胺的合成效率。1.睾酮的糖基多样化研究睾酮-17-O-β-糖苷（TGs）结构种类的扩大将增加从其乙酰化衍生物中筛选出具有抗癌活性化合物的可能性,因此迫切需要挖掘具有供体杂泛性的糖基转移酶,以增加睾酮糖苷的多样性。本研究围绕睾酮的糖基多样化反应进行展开,在OsSGT2的作用下,我们对33种供体进行筛选,实验结果表明睾酮至少可以和8种供体反应产生6种不同结构的睾酮糖苷和二糖苷。结合高效液相、紫外吸收光谱、高分辨质谱以及核磁共振波谱,鉴定了6种化合物的结构,其中3个为新化合物。除此之外,我们还发现OsSGT2具有糖-糖糖基转移酶活性、转糖活性以及高效特异的半乳糖苷酶活性,随后优化糖基化反应条件并测定了酶促动力学参数。2.定点突变提高N-乙酰葡萄糖胺的催化效率OsSGT2催化睾酮糖基多样化反应过程中,UDP-GlcNAc、UDP-Gal、绣线菊苷和UDP-Rha的转化率均小于10%。通过同源模件、分子对接和定点突变,发现395位氨基酸有助于降低反应的空间位阻和稳定UDP-N-乙酰葡萄糖胺的构象,通过蛋白质工程改造以期提高UDP-N-乙酰葡萄糖胺的转化率。将395位苯丙氨酸进行了饱和突变,筛选到了 8个能提高N-乙酰葡萄糖胺的突变体,其中突变株F395C的转化率高达72.11±7.82%,是野生型的8倍。本研究为拓展睾酮糖苷的结构多样性增加了一个选择,也对其它糖基转移酶定点突变提高催化效率提供了范例。3.OsSGT2催化其它受体的糖基多样化反应除了研究OsSGT2催化睾酮的糖基多样化反应之外,我们还利用31种不同结构的受体和33种糖基供体进行受体宽泛性和供体宽泛性的研究,并通过高效液相色谱、紫外吸收光谱、高分辨质谱和核磁共振波谱对糖基化产物进行了结构鉴定。结果表明OsSGT2可以催化蟾毒灵、漆黄素、阿比特龙和（20R/S）-原人参三醇发生多样化的糖基反应,进而生成相应的糖苷产物,这也证实了 OsSGT2既具有受体宽泛性,也具有供体宽泛性,为生物合成糖苷提供了强有力的元器件。

关键词：睾酮糖基转移酶糖基多样化定点突变

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大环内酯类抗生素麦迪霉素糖基化失活机制的研究

大环内酯类抗生素麦迪霉素糖基化失活机制的研究

引用

作者：林茹北京协和医学院

学位级别：硕士

大环内酯类抗生素（macrolides antibiotics）通过与细菌核糖体的新生肽出口隧道结合来抑制蛋白质合成,从而导致其生长停滞或死亡,它主要用于治疗由革兰氏阳性菌,部分革兰氏阴性菌以及非典型病原体,在临床应用中发挥着重要作用。然而,... 详细信息

大环内酯类抗生素（macrolides antibiotics）通过与细菌核糖体的新生肽出口隧道结合来抑制蛋白质合成,从而导致其生长停滞或死亡,它主要用于治疗由革兰氏阳性菌,部分革兰氏阴性菌以及非典型病原体,在临床应用中发挥着重要作用。然而,与其他抗生素一样,其广泛应用致使耐药菌不断出现。已有研究表明,这些细菌的耐药机制包括:药物靶点的改变（核糖体）,上调外排泵以及酶法修饰药物,大环内酯产生菌的胞内糖基转移酶（glycosyltransferase,GTs）通过修饰内酯环上6-脱氧己糖的羟基,是导致大环内酯失活的耐药机制之一。了解这些糖基转移酶的结构特点及催化性质,对进一步了解大环内酯耐药机制提供了理论依据。麦迪霉素来源于Streptonyces mycarofaciens,母核是十六元环内酯环,侧链上连接双糖 4’-O-（α-L-mycarosyl）-β-D-mycaminosyl。它对红霉素（erythromycin）敏感菌株和外排泵介导的红霉素耐药菌株均具有活性,可用于治疗上下呼吸道感染。麦迪霉素不仅在临床上有较广泛的应用,也被添加在动物饲料中。然而,麦迪霉素耐药性问题同样引起普遍关注,其耐药性主要是由于磷酸化、还原、脱酰基等引起的药物失活,目前糖基化修饰导致麦迪霉素失活还未见报道。本论文以麦迪霉素为主要研究对象,从四种不同来源的大环内酯类糖基转移酶中筛选出OleD作为催化麦迪霉素糖基化最有效的生物催化剂,同时测定了 OleD的催化功能及酶学性质,通过蛋白质的定向进化提高了其催化麦迪霉素2’-N-乙酰葡萄糖胺的合成效率。体外抑菌实验证实除了葡萄糖外,其他糖的糖基化修饰也会导致麦迪霉素失活。本研究将为大环内酯类抗生素耐药机制的阐明和糖基转移酶抑制剂的开发奠定基础。1.催化大环内酯抗生素糖基转移酶的筛选根据来源及性质的差异,筛选出四种大环内酯抗生素生源途径中的糖基转移酶基因,分别是oleD、desⅦ、spnP、srm289srm/28,构建表达载体并在大肠杆菌中异源表达,纯化的目的蛋白用于后续麦迪霉素与UDP-葡萄糖的糖基化反应。2.麦迪霉素糖基多样化的研究利用体外酶促反应,上述四种糖基转移酶中OleD催化麦迪霉素糖基化效率最高,因此,以OleD作为生物催化剂,催化麦迪霉素与20种糖基供体（包括8种NDP-糖及12种糖苷化合物）进行糖基化反应,生成5种不同结构的麦迪霉素糖苷,但是对UDP-葡萄糖醛酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺以及GDP-甘露糖无催化活性。结合紫外吸收、LC-MS及NMR鉴定了反应中的两种产物为2’-OH取代糖苷,分别为麦迪霉素2’-O-吡喃葡萄糖苷、麦迪霉素2’-O-吡喃木糖苷。3.OleD定向进化由于OleD催化麦迪霉素糖基多样化反应的过程中,UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc）、UDP-鼠李糖（UDP-rhamnose,UDP-Rha）、UDP-半乳糖（UDP-galactose,UDP-Gal）的催化效率较低,因此,通过蛋白质工程对OleD进行定向进化。2VCE是UGT72B1（与OleD具有相似结构的GTs）与 UDP-2-脱氧-2-氟葡萄糖（UDP-2-deoxy-2-fluoroglucose,U2F）复合物,其中,2-脱氧-2-氟葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺都是葡萄糖的衍生物,这为OleD与UDP-GlcNAc的同源性建模提供参考。通过丙氨酸诱变和饱和诱变筛选出16个糖基化UDP-GlcNAc效率提高的突变体,其中Q327F催化麦迪霉素2’-N-乙酰葡萄糖胺合成效率最高,达到34.13±1.55%,比野生型OleD（3.6%）提高了 7倍。4.麦迪霉素糖苷衍生物理化性质及活性测定对制备出的麦迪霉素2’-O-吡喃葡萄糖苷、麦迪霉素2’-O-吡喃木糖苷及麦迪霉素2’-N-乙酰葡萄糖胺测定抑菌活性。结果表明麦迪霉素对小肠芽孢杆菌（Bacillus intestinalis strain T30）,枯草芽孢杆菌（B.subtilis strain 168）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的 MIC 值分别为0.5、1、1和0.25μg/mL,然而三种麦迪霉素2’-O-糖苷的抑菌活性完全丧失,证实在麦迪霉素2’-OH进行糖基化,不论是葡萄糖、木糖或者是N-乙酰葡萄糖胺都会导致麦迪霉素失去抗菌活性,说明麦迪霉素2’位被不同糖基修饰后阻碍其与细菌靶点结合而失活。同时也对麦迪霉素2’-O-吡喃葡萄糖苷的水溶性进行测定。结果表明麦迪霉素2’-O-吡喃葡萄糖苷的水溶性为8.62 mg/mL,是麦迪霉素（0.74 mg/mL）的11倍。大环内酯类抗生素的脂溶性好、细胞穿透性强,麦迪霉素糖苷产物的水溶性提高也可能是其丧失抗菌活性的原因之一。

关键词：糖基转移酶大环内酯糖基多样化定向进化抑菌活性

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