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双子叶植物中CRISPR/Cas精确基因组编辑工具的研究

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双子叶植物中CRISPR/Cas精确基因组编辑工具的研究

作者：袁梦辉河北科技大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas系统具有多靶点编辑、单碱基编辑和基因调控等多种功能,并在多种植物中得到广泛应用。但该系统存在精确编辑效率低的问题,同时在有些植物上的应用也比较薄弱。本研究在模式双子叶植物拟南芥中创建Prime Editing编辑系统,在原... 详细信息

CRISPR/Cas系统具有多靶点编辑、单碱基编辑和基因调控等多种功能,并在多种植物中得到广泛应用。但该系统存在精确编辑效率低的问题,同时在有些植物上的应用也比较薄弱。本研究在模式双子叶植物拟南芥中创建Prime Editing编辑系统,在原生质体细胞中进行了靶向精确编辑,但效率较低。因此,我们对该系统进行升级改造:首先,将反转录酶MMLV分别替换为Ca MV、Retron和MMLV-RH,结果表明三种反转录酶均能进行精确编辑,且MMLV-ΔRH显著提高了Prime Editing的精确编辑效率。同时,我们对peg RNA进行改造,选择在peg RNA的3’端添加Mpknot和Evopre Q1序列,结果表明:添加Mpknot序列的Prime Editing系统的精确编辑效率显著提升。进一步,我们将Sp RY蛋白引入Prime Editing,创建了n Sp RY Prime Editing系统,扩展可编辑范围至7种PAM类型,但编辑效率依旧较低,后期将MMLV-ΔRH反转录酶与Mpknot版本的peg RNA结合,验证是否有加成效果。为了在植物中开发多种精确编辑工具,以满足植物上的多方面需求,本研究还在拟南芥中创建了6种CRISPR-Retron系统,并在原生质体中进行了靶向编辑,但未检测到精确编辑;在植株上,仅Ec86-1检测到1个精确编辑阳性植株,但编辑效率较低。同时,在大麻中还构建了CRISPR/Cas9基因组编辑系统,在原生质体中靶向编辑了Cs THCAS1基因,获得了多个有效的可编辑位点。并为了进一步提高编辑效率,设计了多种sg RNA优化表达方案,包括克隆了大麻中9个PolⅢ型启动子,采用PolⅡ型启动子结合t RNA和HH-HDV序列,以期提高sg RNA的表达效率。并且还设计了Prime Editing系统,后续实验正在进行。

关键词： CRISPR/Cas 精确编辑 Retron 拟南芥大麻

CRISPR/Cas9基因编辑系统的发展及其在医学研究领域的应用

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中国比较医学杂志 2019年第2期29卷 116-123页

作者：朱佩琪蒋伟东周诺广西医科大学附属口腔医院南宁530021 广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室南宁530021 广西颅颌面畸形临床医学研究中心南宁530021 颌面外科疾病诊治研究重点实验室(广西高校重点实验室) 南宁530021

近年来,CRISPR/Cas9技术凭借着其操作方便、设计简单、效率高、成本低以及可同时进行多位点编辑等优势,已成为当今最热的新一代基因编辑技术。CRISPR/Cas9独特的在RNA引导下对DNA进行靶向编辑的作用机制,不仅拓展了各相关领域的科研工... 详细信息

近年来,CRISPR/Cas9技术凭借着其操作方便、设计简单、效率高、成本低以及可同时进行多位点编辑等优势,已成为当今最热的新一代基因编辑技术。CRISPR/Cas9独特的在RNA引导下对DNA进行靶向编辑的作用机制,不仅拓展了各相关领域的科研工作者们对生物体遗传调控的了解,更显示出优良的便捷性。近十年来,该系统在各生物、医学研究领域应用极为广泛,发展迅速。在医学领域,更是显示出极大的潜力。本文从CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究历史、作用机理以及该技术在医学领域的应用等方面综述其最新研究进展,为更好地应用和优化CRISPR/Cas9提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9 基因治疗精确编辑脱靶效应风险

CRISPR/Cas9技术存在的问题及其改进措施的研究进展

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生物技术通报 2017年第4期33卷 70-77页

作者：袁伟曦喻云梅胡春财赵祖国广东医科大学微生物学与免疫学教研室湛江524023 解放军第422中心医院湛江524023

CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术,能对基因进行精确性敲除、敲入、替换等,从而实现探究基因功能、修复致病基因等目的。该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑、可拓展性强等优势,在近几年迅速发展完善,已... 详细信息

CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术,能对基因进行精确性敲除、敲入、替换等,从而实现探究基因功能、修复致病基因等目的。该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑、可拓展性强等优势,在近几年迅速发展完善,已成为继锌指核酸酶技术和类转录激活因子效应物核酸酶技术之后的第三大基因组编辑技术。在简单介绍CRISPR/Cas9技术的作用机制后,主要针对该技术现阶段面临的精确修复比例低、PAM限制识别序列、脱靶现象、马赛克现象的问题以及相应的改进措施进行阐述,旨在让研究者客观的认识CRISPR/Cas9技术存在的不足之处,为合理使用或改进该技术提供系统的文献综述。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑精确编辑脱靶马赛克现象

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引导编辑系统的研究与应用进展

畜牧兽医学报 2022年第11期53卷 3721-3730页

作者：邹惠影李俊良朱化彬中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

引导编辑系统是基于CRISPR/Cas9系统新开发出的一种基因编辑技术,可以精确实现12种碱基的互换、插入和缺失,并且不需要产生双链断裂和引入外源供体DNA。本文从基因编辑的发展历程、引导编辑系统的组成和特点、引导编辑系统的优化、引导... 详细信息

引导编辑系统是基于CRISPR/Cas9系统新开发出的一种基因编辑技术,可以精确实现12种碱基的互换、插入和缺失,并且不需要产生双链断裂和引入外源供体DNA。本文从基因编辑的发展历程、引导编辑系统的组成和特点、引导编辑系统的优化、引导编辑系统在动物和植物研究中的应用、引导编辑系统的设计和脱靶效应等几个方面详细的对引导编辑系统近几年的研究及应用概况进行了综述,为促进科研工作者了解引导编辑系统及进一步推进引导编辑系统在动物和植物科学基础研究和育种方面的应用提供参考。

关键词：基因编辑技术引导编辑系统精确编辑应用研究