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氯虫苯甲酰胺对二化螟亚致死效应的研究

氯虫苯甲酰胺对二化螟亚致死效应的研究

作者：黄莉扬州大学

学位级别：硕士

二化螟(Chilo suppressalis) (Lepidoptera:Pyralidae)是分布于亚洲、中东和欧洲南部的重要水稻害虫。目前,对二化螟的防治主要依赖于化学农药,但随着化学农药的不合理使用,二化螟已对三唑磷、杀虫单、氟虫腈等常用杀虫剂产生不同程度... 详细信息

二化螟(Chilo suppressalis) (Lepidoptera:Pyralidae)是分布于亚洲、中东和欧洲南部的重要水稻害虫。目前,对二化螟的防治主要依赖于化学农药,但随着化学农药的不合理使用,二化螟已对三唑磷、杀虫单、氟虫腈等常用杀虫剂产生不同程度的抗性。氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是美国杜邦公司开发的邻甲酰氨基苯甲酰胺类新型杀虫剂,对鳞翅目害虫具有卓越的杀虫活性。自从2008年进入中国市场后,氯虫苯甲酰胺已经被广泛用于防治包括二化螟在内的鳞翅目害虫。本文研究了氯虫苯甲酰胺对二化螟生长发育、生殖和温度耐受性的亚致死效应。研究结果对于进一步深入了解杀虫剂亚致死效应机制以及科学合理使用氯虫苯甲酰胺具有重要的理论意义和实践价值。采用饲料混毒法,确定了氯虫苯甲酰胺对二化螟3龄幼虫的亚致死浓度(LC1o和LC30),并研究其对二化螟生长发育的影响。结果表明,经氯虫苯甲酰胺LC1o和LC30处理的幼虫从3龄到6龄的发育时间(16.15天和17.14天)与对照(14.80天)相比显著推迟,并且LC30处理后从蛹到成虫的发育历期(9.03天)与对照(6.66天)相比显著延长,但LC1o处理对蛹到成虫的发育历期(7.05天)无显著影响。经LClo和LC30处理的雄成虫寿命与对照相比显著缩短,但雌成虫的寿命没有显著变化。LC1o和LC30处理组幼虫体重(5.72 mg和3.40mg)显著低于对照(12.47 mg)。LC1o和LC30处理组雄蛹重(46.74 mg和44.94 mg)显著低于对照(50.49 mg),LC30处理组雌蛹重(49.31 mg)也显著低于对照(59.79 mg),但LC1o处理组雌蛹重没有显著变化。另外,LC1o和LC30处理组化蛹率(41.30%和23.98%)显著低于对照(71.86%),但成虫羽化率没有显著变化。与对照相比,LC1o和LC30处理组雌虫产卵量分别下降了32.18%和52.94%,但雌虫百分率及卵孵化率与对照相比没有显著差异。利用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟卵黄原蛋白基因5,732 bp全长cDNA (CsVg)。CsVg开放阅读框长5373 bp,编码1790个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为204.63 kDa。序列分析发现CsVg具有Vitellogenin-N结构域(pfam01347,32-742位氨基酸),DUF1943结构域(pfam09172,775-1056位氨基酸)和VWD结构域(pfam000940,1460-1626位氨基酸)。酶切位点RVRR位于氨基端362-365位氨基酸,两个多聚丝氨酸区分别位于334-345和387-397位氨基酸。多重序列比对发现CsVg与稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis (AEM75020)、棉铃虫Helicoverpa armigera (AFV40972)、斜纹夜蛾Spodoptera litura (ABU68426) Vg基因的氨基酸序列一致性分别为59%,52%,50%。此外,CsVg羧基端DGXR (1591-1594)和GL/ICG (1608-1611)基序以及6个半胱氨酸残基在二化螟和其它鳞翅目昆虫中也高度保守。应用RT-qPCR对CsVg瞻表达模式分析发现,CsVg在雌蛹和雌成虫各个发育阶段都有表达,随着蛹期发育表达水平逐渐上升,在羽化12h的雌虫中表达水平达到高峰,羽化24h后表达水平显著下降。经LC10和LC30浓度氯虫苯甲酰胺处理后,羽化12h的雌成虫CsVg的表达水平与对照相比分别显著降低了42.52%和47.84%。经LC30浓度氯虫苯甲酰胺处理的羽化24h的雌虫CsVg的表达水平也显著降低,但经LC1o浓度氯虫苯甲酰胺处理的羽化24h的雌虫CsVg的表达水平与对照相比无显著差异。氯虫苯甲酰胺对二化螟温度耐受性的亚致死效应研究发现,LC10和LC30浓度氯虫苯甲酰胺处理的幼虫经过LT50热激后,处理组二化螟幼虫的死亡率显著高于对照组。进一步研究了亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对二化螟热激蛋白基因和精氨酸激酶基因CsAg表达水平的影响。经42℃热激后,LC10和LC30氯虫苯甲酰胺处理组幼虫hsp60和hspl9.8的mRNA表达水平显著升高,其中hsp60的mRNA表达水平分别是对照的2.05和2.13倍,hsp19.8的mRNA表达水平分别是对照的1.92和2.56倍。LC10氯虫苯甲酰胺处理组幼虫hsp70和hsp21.7a的mRNA表达水平显著高于对照,分别为对照的2.27倍和2.24倍。LC10和LC30氯虫苯甲酰胺处理组幼虫hsp90、hsp21.7b、hsp21.4和hsp21.5的mRNA表达水平较对照均无显著差异。对CsAg基因的研究发

关键词：二化螟氯虫苯甲酰胺亚致死效应卵黄原蛋白热激蛋白精氨酸激酶 Real-timePCR

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糖基修饰改性对拟穴青蟹过敏原性质的影响

糖基修饰改性对拟穴青蟹过敏原性质的影响

作者：阮韦伟集美大学

学位级别：硕士

食物过敏已成为21世纪人们日益关注的食品安全和公共卫生问题。蟹类作为联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一，近年来其致敏发病率呈逐渐上升趋势。原肌球蛋白（tropomyosin, TM）和精氨酸激酶（arginine kinase,AK）是蟹类的重要... 详细信息

食物过敏已成为21世纪人们日益关注的食品安全和公共卫生问题。蟹类作为联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一，近年来其致敏发病率呈逐渐上升趋势。原肌球蛋白（tropomyosin, TM）和精氨酸激酶（arginine kinase,AK）是蟹类的重要过敏原。研究表明，过敏原一般为酸性等电点的糖蛋白，糖结构在参与抗原决定簇形成的过程中发挥了重要作用，但是目前关于TM和AK糖蛋白性质的研究报道较少。因此，深入探讨糖基修饰改性对TM和AK性质的影响，对于全面了解蟹类过敏原和开发低免疫活性食品具有重要意义。本研究以拟穴青蟹（Scylla paramamosain）为原料，首先完成TM和AK的分离纯化，应用过碘酸雪夫（PAS）染色法、苯酚-硫酸法、β-消除法和分子生物学方法鉴定TM和AK的糖蛋白性质，同时比较水产品中不同过敏原的含糖量。其次通过酶法和化学法去除糖链，并采用现代生物技术分析去糖基化修饰对TM和AK免疫活性的影响。最后，研究基于美拉德反应的糖基化改性对TM、AK的免疫活性与消化稳定性的影响。应用等电点沉淀、硫酸铵盐析、柱层析等方法提取纯化TM和AK，通过PAS染色法、苯酚-硫酸法、β-消除法和分子生物学方法证实TM和AK均为糖蛋白，含糖量分别为0.2%和1.7%，且均只含有O-糖苷键。对比其他水产品过敏原发现，贝类、章鱼TM的含糖量比虾蟹类TM高，蟹AK含糖量比虾AK高。酶法去糖基化修饰不会改变TM和AK的分子量大小，应用蟹类过敏患者血清的IgE western-blotting和抑制性ELISA发现酶法去糖基化修饰不会影响TM和AK的IgE结合活性，而高碘酸处理则会导致TM和AK的IgE结合活性急剧下降。在美拉德反应中，TM和AK与核糖发生反应的速率比葡萄糖快，其中TM发生糖基化修饰的速率比AK快。与干法-美拉德反应相比，湿法-美拉德反应的反应速率较慢。基于美拉德反应的糖基化修饰会导致TM和AK的IgE结合活性下降，同时还会增加TM对胰蛋白酶的消化的耐受性和AK对胃蛋白酶消化的耐受性。干法-美拉德反应会使粗蛋白中TM的糖基化修饰速率加快，并增强AK的抗体识别能力。总的来说，本研究首次对拟穴青蟹过敏原TM和AK的糖蛋白性质进行了分析，确定了TM和AK分别为含糖量0.2%和1.7%，均只含有O-糖苷键的糖蛋白。研究糖结构对TM和AK免疫活性的影响，实验结果表明高碘酸钠处理比酶法去除糖链更有效地降低TM和AK的IgE结合活性。基于美拉德反应的糖基化修饰中，干法比湿法反应更明显，其中TM的反应速率比AK更快且糖基化程度更高。美拉德反应能提高TM对胰蛋白酶消化的耐受性以及AK对胃蛋白酶消化的耐受性。粗蛋白发生美拉德反应会增加AK的抗原性。这些结果可望为全面研究蟹类过敏原、开发低免疫活性食品或减弱变应原等奠定基础。

关键词：拟穴青蟹原肌球蛋白精氨酸激酶去糖基化美拉德反应 IgE结合活性

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章鱼过敏原的研究

章鱼过敏原的研究

作者：沈海旺集美大学

学位级别：硕士

食物过敏是人类比较常见的一种过敏性疾病，主要是由食物中的过敏原引起。人们发生食物过敏后，常出现腹泻、哮喘、呕吐等症状，严重时会虚脱、休克，甚至危及生命。水产类食物作为重要的过敏食物之一，由其引起的过敏反应引起了世界人... 详细信息

食物过敏是人类比较常见的一种过敏性疾病，主要是由食物中的过敏原引起。人们发生食物过敏后，常出现腹泻、哮喘、呕吐等症状，严重时会虚脱、休克，甚至危及生命。水产类食物作为重要的过敏食物之一，由其引起的过敏反应引起了世界人们的关注，在联合国粮农组织公布的八大类过敏食物中，水产品就占了两大类。章鱼作为重要的水产资源，因其肉质鲜嫩、味道鲜美，具有很高的营养价值，深受消费者喜爱。随着章鱼消费量的增加，有关章鱼过敏的报道也随之增多，但是关于章鱼过敏原的研究较少，集中于主要过敏原—原肌球蛋白（TM）的纯化及分析，对于章鱼是否含有其他过敏原以及如何开发低致敏性章鱼产品等方面尚未见报道。本实验首先对章鱼TM进行分离纯化、鉴定及性质分析，并制备多克隆动物抗体;然后对章鱼TM分别进行超声联合加热、紫外照射、高温高压和美拉德反应等加工处理方式;并采用模拟胃肠液消化实验对不同处理后TM的消化稳定性进行分析，进一步运用水产食物过敏患者血清对其致敏性进行鉴定;最后，对章鱼肌肉进行热处理和高温高压处理，分析肌肉蛋白和TM的性质变化。结果显示，纯化章鱼TM的分子量为35kDa，与蟹类TM具有免疫交叉反应，是含糖量为1.3%的糖蛋白，且对热和酸碱稳定;超声联合加热和紫外照射对章鱼TM消化稳定性及免疫活性影响不明显，高温高压处理能够有效降低TM的消化稳定性和免疫活性;章鱼TM与葡萄糖发生美拉德反应，随着反应时间的延长，其产物的免疫活性逐渐降低，但其消化稳定性却有所增加;对章鱼肌肉进行100℃蒸煮10min和高温高压10min处理，发现两种处理方式均能够一定程度地降低章鱼TM的消化稳定性，且高温高压处理效果更显著。本实验还对章鱼精氨酸激酶（AK）进行分离纯化及鉴定，制备多克隆抗体;然后对其致敏性、热稳定性、pH稳定性及消化稳定性等理化性质进行分析;最后将其与甲壳类动物过敏原AK进行分析比较。结果显示，采用水产食物过敏患者血清对章鱼肌浆蛋白进行免疫反应，发现能与血清发生特异性反应的有50kDa、38kDa和26kDa蛋白组分，其中最主要的是38kDa蛋白组分;进一步纯化得到该38kDa蛋白组分，应用肽指纹图谱对其进行分析鉴定，确定为章鱼AK;对章鱼AK的致敏性进行分析，确定其为章鱼的一种新型过敏原，并制备得到了效价较高的多克隆动物抗体;章鱼AK是含糖量为1.1%的糖蛋白，且对热和酸碱均不稳定，经过不同条件的热处理和pH处理后，章鱼AK的免疫活性均受到明显影响;章鱼AK容易被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等消化酶降解。对章鱼AK进行分子克隆，得到其全长基因序列和氨基酸序列，并将章鱼AK与甲壳类动物过敏原AK进行比较分析。结果显示，章鱼AK氨基酸序列比甲壳类动物AK少8个氨基酸残基，且二者序列相似性仅为54%，但二者蛋白三维结构高度相似，且抗原表位预测结果同样具有一定的相似性;章鱼AK能和甲壳类动物AK的多克隆动物抗体发生明显的免疫交叉反应;此外，章鱼AK与甲壳类动物AK具有相似的致敏性，蟹AK能够抑制章鱼AK与IgE之间的特异性反应。总之，本研究主要是对章鱼的过敏原TM和AK进行了详细分析。首先是对章鱼的主要过敏原TM进行模拟加工处理，以期筛选出能够有效降低章鱼TM消化稳定性和免疫活性的加工方法;其次是首次证明了AK是章鱼的一种新型过敏原，并对其理化性质进行进一步分析，同时将其与虾蟹过敏原AK进行比较，分析二者之间的相似性。这些结果可望为开发低致敏性章鱼产品提供技术参考，为章鱼过敏的诊断和治疗提供理论依据。

关键词：章鱼过敏原原肌球蛋白精氨酸激酶纯化分子克隆

粘虫EF-1a和AK基因的克隆及实时RT-PCR方法建立

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中国农学通报 2016年第11期32卷 27-32页

作者：段云巩中军蒋月丽吴潇博李彤苗进武予清河南省农业科学院植物保护研究所河南省农作物病虫害防治重点实验室/农业部华北南部有害生物治理重点实验室郑州450002

为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR GreenⅠ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲... 详细信息

为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR GreenⅠ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲线和标准曲线分析等建立实时RT-PCR方法。结果表明,从粘虫中克隆获得EF-1a和AK基因片段长度分别为622 bp和1020 bp,分别编码207个氨基酸和339个氨基酸;序列同源性分析结果表明,粘虫EF-1a与鳞翅目昆虫家蚕、桦尺蠖和柑桔凤蝶的氨基酸序列同源性为95%以上;AK与鳞翅目昆虫草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的氨基酸序列同源性为98%以上。熔解曲线和标准曲线结果显示,设计的EF-1a和AK基因引物均可应用于实时RT-PCR扩增。

关键词：粘虫延伸因子精氨酸激酶克隆反转录实时定量PCR

美洲蟑螂重组BCG-Arg变应原致BALB/C小鼠的免疫原性评估

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生物医学工程研究 2011年第3期30卷 188-190页

作者：张玉振梁建卫周珍文广州市干部疗养院广州510530 广州市妇女儿童医疗中心广州510120

对表达美洲蟑螂Arg变应原的BCG进行免疫原性评估,为BCG脱敏疫苗的研制奠定基础。106CFU重组BCG-Arg皮下注射免疫BALB/C小鼠,分别于免疫0、2、4、6、8周收集血清。使用纯化的重组Arg包被ELISA板,ELISA检测Arg特异性IgG及IgG1I、gG2a亚类... 详细信息

对表达美洲蟑螂Arg变应原的BCG进行免疫原性评估,为BCG脱敏疫苗的研制奠定基础。106CFU重组BCG-Arg皮下注射免疫BALB/C小鼠,分别于免疫0、2、4、6、8周收集血清。使用纯化的重组Arg包被ELISA板,ELISA检测Arg特异性IgG及IgG1I、gG2a亚类。重组BCG-Arg皮下注射免疫BALB/C小鼠2周后,血清Arg特异性IgG显著高于对照组(P<0.05),实验组IgG1及IgG2a也显著高于对照组(P<0.05),IgG2a升高更明显。重组美洲大蠊BCG-Arg具免疫原性,并且诱导Th1优势免疫应答。

关键词：美洲大蠊精氨酸激酶卡介苗变应原疫苗免疫应答