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精子相关抗原6(SPAG6)与TCTE3蛋白间相互作用探讨

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重庆医科大学学报 2017年第8期42卷 948-952页

作者：双超凡柳赟昊刘晙玭闵洁李梦颖桂媛黄金宇张玲张志兵武汉科技大学医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室武汉430065 弗吉利亚联邦大学妇产科学系弗吉利亚里士满23298

目的:探讨精子相关抗原6(sperm associated antigen 6,Spag6)和T复合体相关睾丸表达3(T-complex associated testis expressed 3,TCTE3)之间的相互作用。方法:PCR法观察Tcte3在雄性小鼠各组织中的表达;以小鼠睾丸c DNA为模板,扩增Tcte3序列,构建Tcte3/p GADT7、Tcte3/p EGFPN2重组质粒;以Tcte3/p EGFPN2转染CHO细胞和COS-1细胞,免疫荧光染色及Western blot检测TCTE3在细胞中的定位和表达;以Spag6/p GBKT7和Tcte3/p GADT7进行酵母双杂交实验,提取酵母蛋白后采用Western blot检测TCTE3与SPAG6之间是否存在直接的相互作用。结果:Tcte3在睾丸、脑、肝、肾、肺、脾、肌肉中均有表达;酶切和测序鉴定证实Tcte3/p GADT7和Tcte3/p EGFPN2重组质粒均构建成功;体外实验发现TCTE3主要在CHO和COS-1细胞质中表达,当与SPAG6质粒共转染后,TCTE3被募集至细胞微管中表达;酵母双杂交实验显示TCTE3/SPAG6组合后,在缺少SD/-Leu/-Trp/-His的培养板上有菌落生成,Western blot显示菌落中TCTE3、SPAG6蛋白表达显著,分子量正确。结论:精子相关抗原SPAG6与TCTE3之间存在直接的相互作用,SPAG6可募集TCTE3至细胞微管中表达。

关键词：男性不育精子相关抗原6 T复合体相关睾丸表达3 酵母双杂交蛋白表达

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精子相关抗原6与肿瘤早期诊断的研究进展

中国男科学杂志 2014年第11期28卷 61-63,69页

作者：平光伦汪智琼张玲石玉琴江高峰张双玲刘晙玭张志兵武汉科技大学医学院公共卫生学院武汉 430065 Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry Virginia Commonwealth UniversityRichmondVA 23298

精子相关抗原6（SPAG6）为新发现的癌睾丸抗原（cancer-testis antigens, CTA）家族的一员，是一种具有巨大肿瘤早期诊断的前景蛋白。SPAG6基因是1999年Neilson等[1]在用男性不育患者的高滴度抗精子抗体血清来筛选睾丸表达基因文库时克... 详细信息

精子相关抗原6（SPAG6）为新发现的癌睾丸抗原（cancer-testis antigens, CTA）家族的一员，是一种具有巨大肿瘤早期诊断的前景蛋白。SPAG6基因是1999年Neilson等[1]在用男性不育患者的高滴度抗精子抗体血清来筛选睾丸表达基因文库时克隆出来的。目前发现SPAG6在肿瘤组织中的特异性表达，以及其能引起特异性的体液免疫应答的特点，均符合肿瘤生物标记物的筛选标准。因此该基因可能适用于肿瘤早期诊断。本文就国内研究相对较少的SPAG6的基本特征、功能以及其与肿瘤早期诊断作一下概述。

关键词：精子相关抗原6 肿瘤/诊断

精子相关抗原6（SPAG6）及其结合蛋白在调控精子发生中的作用

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精子相关抗原6（SPAG6）及其结合蛋白在调控精子发生中的作用

作者：袁硕武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:研究精子相关抗原6（SPAG6）与多种蛋白的相互作用,探讨SPAG6对小鼠精子发生过程的调控作用。方法:首先以小鼠睾丸组织cDNA文库为对象,使用酵母双杂交实验筛选出几种最可能与SPAG6相结合的蛋白,随后采用直接酵母双杂交实验证实这... 详细信息

目的:研究精子相关抗原6（SPAG6）与多种蛋白的相互作用,探讨SPAG6对小鼠精子发生过程的调控作用。方法:首先以小鼠睾丸组织cDNA文库为对象,使用酵母双杂交实验筛选出几种最可能与SPAG6相结合的蛋白,随后采用直接酵母双杂交实验证实这些蛋白与SPAG6产生相互作用;以野生型雄性小鼠为对象,选择第一波精子发生阶段,即小鼠出生后第6、8、12、16、20、24、28、30、35和42天的睾丸组织样本,Western blotting实验研究SPAG6、Snapin及COPS5的表达。以CHO细胞为对象,体外将pTarget/SPAG6分别和pEGFP-N2/Snapin、pEGFP-N2/COPS5以及pEGFP-N2/TCTE3表达质粒转染到细胞中,免疫荧光实验观察SPAG6与这三种蛋白是否在体细胞中存在共定位。以COS-1细胞为对象,体外将SPAG6/GFP分别和Snapin/Flag、COPS5/Flag以及TCTE3/Flag表达质粒转染到细胞中,免疫共沉淀实验（Co-IP）验证SPAG6与这三种蛋白间的相互作用。以Spag6基因敲除雄性小鼠为实验组,野生型雄性小鼠为对照组,H＆E染色观察两组小鼠形态学上的差异;免疫荧光实验观察两组小鼠睾丸组织的生精细胞中SPAG6、Snapin及SPAG16L的定位;免疫荧光实验观察两组睾丸组织石蜡切片中SPAG6、Snapin和COPS5的定位。结果:酵母双杂交实验筛选出了多种具有不同功能的蛋白质,包括Snapin、COPS5、TCTE3、SPAG16L等。Snapin在雄性生殖细胞中具有与SPAG6相类似的定位,SPAG6与Snapin的C末端存在相互作用,进一步研究发现是SPAG6的199到280位氨基酸序列介导了SPAG6与Snapin之间的相互作用。Snapin在CHO细胞中定位于细胞质中,当其和SPAG6共表达时,两者有部分产生共定位;Flag抗体可将Snapin和SPAG6从细胞裂解液中共同沉淀,表示这两种蛋白之间存在相互作用。COPS5在CHO细胞中存在于整个细胞质,与SPAG6共表达时,则聚集在核膜附近;Co-IP实验发现Flag抗体可分别将COPS5和TCTE3与SPAG6从细胞裂解液中共同沉淀,表明COPS5和TCTE3与SPAG6之间存在相互作用。SPAG16L存在于圆形精子细胞的细胞质和长形精子细胞的精子领中,在Spag6基因敲除小鼠中,SPAG16L仍存在于圆形精子细胞的细胞质中,但在长形精子细胞中仅存在痕量的SPAG16L,表示它在精子领中的定位消失。在野生型雄性小鼠中,SPAG6存在于精母细胞的胞浆囊泡、圆形精子和长形精子的顶体以及长形精子的精子领（manchette）中。比较Spag6基因敲除雄性小鼠（实验组）和野生型雄性小鼠（对照组）的睾丸组织结构形态,发现实验组小鼠睾丸组织中精子发生的晚期阶段受到干扰,生精小管的管腔发育迟缓,长形期精子细胞头部畸形,生精周期13-16阶段发生混乱,有细胞质裂片和残留体的异常形成。结论:SPAG6可能通过与其结合蛋白如Snapin、COPS5等形成复合物,影响雄性小鼠不同发育阶段生殖细胞以调控精子的发生。

关键词：精子相关抗原6 SNARE相关蛋白光发生因子9复合体第5亚基蛋白间的相互作用精子发生

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中华男科学杂志 2017年第8期23卷 703-707页

作者：侯方圆李玉山杨夕阳王全先刘军杰王琳凯苏彦华孙琳郑州大学第三附属医院人类精子库河南郑州450052

目的:探讨溶质载体家族22成员14(SLC22A14)和精子相关抗原6(SPAG6),在特发性弱精子症患者精子中的表达情况。方法:收集精子库合格捐精者(正常对照组)和特发性弱精子症患者(弱精子症组)各50例精子样本,采用非连续密度梯度离心纯化精子,... 详细信息

目的:探讨溶质载体家族22成员14(SLC22A14)和精子相关抗原6(SPAG6),在特发性弱精子症患者精子中的表达情况。方法:收集精子库合格捐精者(正常对照组)和特发性弱精子症患者(弱精子症组)各50例精子样本,采用非连续密度梯度离心纯化精子,分别用RT-PCR和Western印迹检测SLC22A14、SPAG6 mRNA及蛋白的表达。结果:RT-PCR检测结果显示,弱精子症组的SLC22A14、SPAG6 mRNA表达均显著低于正常对照组(SLC22A14:0.53±0.10 vs 0.77±0.08,t=12.834,P6:0.52±0.10 vs 0.77±0.06,t=13.755,P精子症组的SLC22A14和SPAG6蛋白表达量同样均显著低于正常对照组,分别为(SLC22A14:0.55±0.10 vs 0.80±0.09,t=12.884,P6:0.56±0.09 vs 0.78±0.09,t=12.257,P精子症患者中SLC22A14和SPAG6表达降低可能是导致弱精子症的重要原因之一。

关键词：溶质载体家族22成员14 精子相关抗原6 特发性弱精子症精子逆转录-聚合酶链反应蛋白印迹

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精子相关抗原6在肝癌组织中的表达及意义

临床肝胆病杂志 2017年第10期33卷 1955-1960页

作者：谷君明曹毅魏鹏中南大学湘雅医院普外科长沙410008

目的检测精子相关抗原6（Spag6）在肝癌组织中的表达情况及其与肝癌患者临床病理特征和预后的关系,探讨Spag6对肝癌细胞HCCLM3增殖和迁移的影响。方法选取2006年8月-2009年11月来自中南大学湘雅医院的102例肝癌患者组织样本进行研究,应... 详细信息

目的检测精子相关抗原6（Spag6）在肝癌组织中的表达情况及其与肝癌患者临床病理特征和预后的关系,探讨Spag6对肝癌细胞HCCLM3增殖和迁移的影响。方法选取2006年8月-2009年11月来自中南大学湘雅医院的102例肝癌患者组织样本进行研究,应用Western Blot检测肝癌细胞系、正常肝组织、肿瘤组织及对应的癌旁组织中Spag6表达水平。利用免疫组化法检测102例肝癌组织中Spag6的表达,并根据肿瘤组织免疫组化评分标准分成Spag6高表达组和低表达组。用慢病毒介导的RNAi干扰技术沉默Spag6基因在HCCLM3细胞中的表达,Western Blot检测沉默效果;利用细胞划痕愈合实验检测沉默Spag6基因后对HCCLM3细胞迁移的影响,集落形成实验观察对细胞增殖的影响。采用χ2检验分析Spag6表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系;利用Kaplan-Meier生存分析、log-rank检验分析Spag6表达水平与肝癌患者预后的关系。结果 Spag6在肝癌细胞系和肝癌组织中表达高于正常LO2细胞以及正常肝组织。免疫组化结果显示102例标本中肝癌组织的Spag6的表达率为58.8%（60/102）,癌旁组织中Spag6的表达率为12.7%（13/102）,差异有统计学意义（χ2=47.123,P〈0.001）。Spag6的表达水平与肿瘤结节数目、有无包膜、血管侵犯、Edmondson-Steiner分级有关（χ2值分别为8.360、6.761、4.344、7.172,P值分别为0.004、0.009、0.037、0.007）。进一步研究显示Spag6高表达组的1、3、5年生存率明显低于低表达组（71.5%vs 90.5%,43.7%vs 68.8%,19.79%vs48.7%;χ2=11.228,P=0.001）。细胞实验证实沉默Spag6基因后HCCLM3细胞增殖和迁移能力明显减弱（P值均〈0.01）。结论Spag6在肝癌细胞及肝癌组织中均呈高表达,且其高表达与肝癌不良临床病理特征以及术后生存有关;Spag6能够促进肝癌细胞增殖和迁移运动,提示Spag6参与了肝癌的发生发展,可作为判断肝癌患者预后的参考指标以及治疗的可能靶点。

关键词：肝肿瘤精子相关抗原6

SPAG6/SPINK2蛋白复合物在小鼠精子顶体形成中的作用初探

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中华男科学杂志 2019年第3期25卷 202-208页

作者：张宏伟张玲陈雅梦申鑫王恒琦柳赟昊张志兵武汉科技大学医学院公共卫生学院环境卫生与职业医学系职业危害识别与控制湖北省重点实验室湖北武汉430065 Department of Obstetrics and Gynecology Wayne State University

目的:初步探讨精子相关抗原6(SPAG6)在小鼠精子发生过程中顶体形成阶段的表达及其调控作用。方法:采用Western印迹检测出生后小鼠睾丸发育不同阶段(第8、12、16、20、24、28、30、35天)中SPAG6的表达;免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定... 详细信息

目的:初步探讨精子相关抗原6(SPAG6)在小鼠精子发生过程中顶体形成阶段的表达及其调控作用。方法:采用Western印迹检测出生后小鼠睾丸发育不同阶段(第8、12、16、20、24、28、30、35天)中SPAG6的表达;免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定位;分别构建SPAG6和SPINK2蛋白表达质粒,以AH109和CHO细胞为对象,采用酵母双杂交及细胞内共定位实验检测SPAG6与SPINK2蛋白间相互作用;免疫荧光检测SPINK2在SPAG6基因敲除(KO)小鼠的睾丸生精细胞中的表达与定位。结果:小鼠出生后第16～28天,SPAG6表达显著升高,且定位于圆形精子细胞的顶体;酵母双杂交实验显示SPAG6/SPINK2组能在选择性培养基(SD/-Leu/-Trp/-His)中生长;CHO细胞共转染SPAG6和SPINK2表达质粒时,SPAG6与SPINK2共定位在细胞核周围;SPAG6 KO小鼠睾丸生精细胞中未检测到SPINK2表达及定位于精子顶体。结论:SPAG6与SPINK2形成蛋白复合体,并可能通过调控SPINK2的稳定表达参与精子顶体形成。

关键词：精子相关抗原6 丝氨酸蛋白酶抑制剂2 小鼠精子顶体雄性不育

SPAG6基因沉默和地西他滨对SKM-1细胞凋亡和PTEN甲基化的影响

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中华血液学杂志 2021年第12期42卷 1005-1010页

作者：罗洁牟佼刘林重庆医科大学附属第一医院血液科 400016 重庆医科大学实验研究中心 400016

目的探讨SPAG6基因沉默和地西他滨在体内外对SKM-1细胞凋亡和PTEN启动子甲基化的作用。方法慢病毒载体转染SKM-1细胞沉默SPAG6基因的表达,地西他滨处理细胞后CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot和甲基化特异性PC... 详细信息

目的探讨SPAG6基因沉默和地西他滨在体内外对SKM-1细胞凋亡和PTEN启动子甲基化的作用。方法慢病毒载体转染SKM-1细胞沉默SPAG6基因的表达,地西他滨处理细胞后CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot和甲基化特异性PCR检测PTEN的蛋白表达和甲基化情况,并构建非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠异体移植瘤模型,TUNEL法观察肿瘤组织凋亡,免疫组化检测PTEN在组织中表达情况。结果慢病毒转染后SPAG6干扰组SPAG6基因被成功沉默;CCK-8检测结果提示地西他滨处理能够降低SKM-1细胞的存活率,同时流式细胞术检测显示地西他滨处理组的细胞凋亡率[(17.35±3.37)%]高于未处理组[(5.09±2.06)%],且SPAG6基因沉默联合地西他滨处理组的凋亡率最高[(36.34±4.00)%];地西他滨处理后DNMT1的表达降低而PTEN表达升高,同时PTEN启动子甲基化程度降低,而经地西他滨处理后的SPAG6干扰组的PTEN去甲基化引起的蛋白表达升高效果最明显;NOD/SCID小鼠异体瘤移植模型中地西他滨组的肿瘤体积明显小于生理盐水组,而地西他滨处理SPAG6干扰组的小鼠肿瘤体积最小,且经TUNEL检测发现其凋亡程度最高(阳性比值为3.57±0.48)。结论SPAG6基因沉默在SKM-1细胞中能增强地西他滨诱导的凋亡和PTEN去甲基化作用,并且在NOD/SCID异体瘤移植模型小鼠中能够增强地西他滨的抗肿瘤特性。

关键词：骨髓增生异常综合征精子相关抗原6 PTEN基因地西他滨

SPAG6通过NF-κB/TNF-α途径促进B-ALL细胞增殖和耐药

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陆军军医大学学报 2024年第24期46卷 2723-2735页

作者：潘施睿罗洁罗菁尹家秀赵海秋苏榕刘林重庆医科大学:附属第一医院血液内科重庆400016 重庆医科大学:实验研究中心重庆400016

目的探究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)对急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)细胞增殖及耐药的相关作用机制。方法纳入2019年1月至2023年12月重庆医科大学附属第一医院血液内科收治的5... 详细信息

目的探究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)对急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)细胞增殖及耐药的相关作用机制。方法纳入2019年1月至2023年12月重庆医科大学附属第一医院血液内科收治的56例B-ALL患者和15例缺铁性贫血(iron-deficiency anemia,IDA)患者,将B-ALL患者作为实验组,IDA患者作为对照组。收集B-ALL患者骨髓组织并提取其骨髓单个核细胞,RT-qPCR检测SPAG6的mRNA表达情况并对B-ALL患者进行分层分析,分为新诊断病例组(New-diag)、完全缓解组(complete remission,CR)、微小残留病(minimal residual disease,MRD)阳性组(MRD+)和复发组(Relapse);使用慢病毒感染构建SPAG6基因过表达(SPAG6-OE)和敲低(SPAG6-KD)的B-ALL细胞系,CCK-8和基于甲基纤维素的集落形成实验检测各组细胞的存活、增殖和成集落潜能;CCK-8检测化疗药物柔红霉素(daunorubicin,DNR)和甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)处理后细胞存活率(可反映其药物敏感性和IC50);从TARGET数据库获取B-ALL患者的mRNA-seq图谱,通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)探索与SPAG6相关的信号通路并进行实验验证;NF-κB激活剂PMA和抑制剂BAY-11-7082作用后,通过CCK-8检测细胞存活率以及对化疗药物的敏感性,Western blot检测通路相关蛋白NF-κB P65、p-NF-κB P65、TNF-α等的表达情况;构建小鼠异种移植瘤模型,-/+敲低SPAG6组腹腔注射生理盐水作为对照组,-/+敲低SPAG6组腹腔注射DNR作为实验组,免疫组化检测NF-κB信号通路在组织中的表达情况。结果B-ALL患者SPAG6 mRNA表达明显高于IDA组(P6高表达于MRD+组(P=0.001)和复发组(P=0.003)。对比不同SPAG6表达水平细胞对化疗药物的反应,CCK-8实验证实SPAG6促进B-ALL细胞增殖(P6通过激活NF-κB/TNF-α通路增强B-ALL细胞对化疗药物的耐药。在体内,敲低SPAG6明显减小小鼠移植瘤体积(P65和p-IKBα水平降低。结论SPAG6通过NF-κB/TNF-α通路促进B-ALL细胞增殖,降低其化疗敏感性,提示SPAG6与B-ALL患者的治疗效果和预后密切相关。

关键词：急性B淋巴细胞白血病精子相关抗原6 细胞增殖耐药 NF-κB/TNFα

Prestin在Spag6基因敲除小鼠外毛细胞中的表达

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山东大学学报（医学版） 2015年第8期53卷 16-22页

作者：王镜涵李霄飞张志兵王海波李建峰山东大学附属省立医院耳鼻咽喉-头颈外科山东济南250021 山东大学医学院病理学与病理生理学教研室山东济南250012 山东省耳科学重点实验室山东济南250021 宾夕法尼亚大学生殖医学及女性健康研究中心美国宾夕法尼亚州费城19104

目的探究prestin在精子相关抗原6(Spag6)基因敲除小鼠中的表达及其与SPAG6之间的关系。方法获取小鼠耳蜗基底膜组织,进行免疫染色,采用共聚焦显微镜观察prestin与SPAG6在毛细胞中的共同分布。比较野生小鼠(Spag6+/+)、杂合型小鼠(Spag6+... 详细信息

目的探究prestin在精子相关抗原6(Spag6)基因敲除小鼠中的表达及其与SPAG6之间的关系。方法获取小鼠耳蜗基底膜组织,进行免疫染色,采用共聚焦显微镜观察prestin与SPAG6在毛细胞中的共同分布。比较野生小鼠(Spag6+/+)、杂合型小鼠(Spag6+/-)和同窝基因敲除小鼠(Spag6-/-)外毛细胞prestin的荧光强度差异和毛细胞的形态改变,并以蛋白印记实验和实时定量聚合酶链反应检测3种基因型小鼠的prestin表达水平。结果SPAG6存在于野生型和杂合型成年小鼠的外毛细胞中,在表皮板处呈阳性表达,与prestin共同分布于外毛细胞的外侧壁处。基因敲除小鼠prestin的荧光强度较野生小鼠更弱,并且外毛细胞出现形态异常。蛋白印迹实验和实时定量聚合酶链反应均显示,基因敲除小鼠prestin表达量显著降低。结论SPAG6参与外毛细胞的构成,且影响外毛细胞prestin表达,提示两种蛋白之间存在相互作用。

关键词：精子相关抗原6 Prestin 外毛细胞基因敲除小鼠听觉障碍