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ADSCs修复邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）对小鼠精原细胞损伤的机制研究

ADSCs修复邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）对小鼠精原细胞损伤的机制研究

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作者：蔺博涵江苏大学

学位级别：硕士

目的:探究邻苯二甲酸二辛酯（di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP）对精原细胞gc-1 spg损伤的可能机制以及脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）和脂肪间充质干细胞来源的胞外囊泡（adipose stem cells-derived extracellular vesicles,ADSCs-EVs）对损伤后的gc-1 spg的修复作用,为临床治疗男性生精系统药物/毒物氧化损伤提供一定的实验依据。方法:（1）提取ADSCs,传代至3～5代进行实验,实验鉴定ADSCs;（2）超速离心法提取ADSCs-EVs,通过纳米粒径跟踪分析技术（NTA）检测ADSCs-EVs的粒径大小分布;透射电子显微镜（TEM）观察ADSCs-EVs的形态;Western-blot实验检测ADSCs-EVs的表面标志蛋白CD 9、CD 63的表达;（3）使用5个不同浓度的DEHP处理gc-1 spg细胞,通过CCK8实验;Transwell实验;克隆形成实验;流式细胞术;Western-blot实验;化学分光光度法检测gc-1 spg细胞内MDA、Fe以及GSH含量;细胞线粒体膜电位检测实验和细胞活性氧检测实验等探究DEHP对gc-1 spg增殖、迁移、克隆、凋亡能力和铁死亡相关机制的影响;（4）建立ADSCs共培养体系,通过上述实验探究ADSCs对损伤后的gc-1 spg增殖、迁移、克隆、凋亡能力和铁死亡相关机制的修复作用;（5）细胞免疫荧光实验观察ADSCs-EVs被gc-1 spg细胞内化的情况,通过上述实验探究ADSCs-EVs对损伤后的gc-1 spg增殖、迁移、克隆、凋亡能力和铁死亡相关机制的修复作用;（6）通过上述实验检测使用铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1）后,其对损伤后的gc-1 spg增殖、迁移、克隆、凋亡能力和铁死亡相关机制的影响。结果:（1）在脂肪组织中成功分离出一种类似纤维细胞的呈现梭形或多边形的细胞,在多次传代后其形态更为典型,使用成骨、成脂诱导剂对其诱导后可定向分化为成骨细胞和脂肪细胞,使用流式细胞术鉴定后该细胞表面标志符合ADSCs特征;（2）TEM镜下可见超速离心所得物质为单个“杯盘状”的纳米膜性囊泡,NTA显示其直径大小在几十到几百纳米之间,Western-blot实验检测到其表达ADSCs-EVs表面标记CD 9和CD 63,符合ADSCs-EVs的鉴定标准;（3）使用5种不同浓度DEHP处理gc-1 spg后,CCK8实验、Transwell实验、克隆形成实验显示DEHP可抑制gc-1 spg的增殖、迁移以及克隆形成能力;流式细胞术显示DEHP会促进gc-1 spg的凋亡;化学分光光度检测显示DEHP使gc-1 spg内的Fe蓄积增加,MDA和GSH含量下降;细胞线粒体膜电位检测实验显示DEHP使gc-1 spg内线粒体膜电位下降;细胞活性氧检测显示DEHP使的gc-1 spg内活性氧含量增加;Western-blot实验显示DEHP使gc-1 spg的铁死亡相关蛋白GPX4和x CT表达下降;（4）细胞免疫荧光实验显示ADSCs-EVs可被gc-1 spg内化摄取;（5）通过上述实验,ADSCs和ADSCs-EVs均促进了损伤的gc-1 spg的增殖、迁移、克隆能力,同时抑制了细胞凋亡,使其细胞内Fe和活性氧含量下降,细胞线粒体膜电位、MDA、GSH、GPX4和x CT表达恢复至损伤前;（6）铁死亡抑制剂处理后,损伤的gc-1 spg的生物学特性以及上述细胞指标均恢复至损伤前。结论:DEHP可通过铁死亡途径抑制gc-1 spg增殖、迁移能力;ADSCs以及ADSCs-EVs可阻断铁死亡通路修复损伤后的gc-1 spg细胞。

关键词： ADSCs ADSCs-EVs 精原细胞gc-1spg 铁死亡 DEHP

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