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微生物学报 2021年第4期61卷 923-934页

作者：蚁烁星周杨张鲜姣姚青李华平朱红惠广东省微生物研究所广东省科学院华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物菌种保藏中心广东广州510070 华南农业大学植物保护学院广东广州510642 华南农业大学园艺学院广东广州510642

【目的】基于模拟原位环境策略、可培养粘细菌的营养策略及细菌互作网络,改良分离培养基,以提高分离粘细菌的多样性。【方法】通过添加土壤浸提液、使用不同种类的诱导菌和改变诱导菌的接种方式设置分离方法,同时以传统的分离方法作对... 详细信息

【目的】基于模拟原位环境策略、可培养粘细菌的营养策略及细菌互作网络,改良分离培养基,以提高分离粘细菌的多样性。【方法】通过添加土壤浸提液、使用不同种类的诱导菌和改变诱导菌的接种方式设置分离方法,同时以传统的分离方法作对照。【结果】改良的分离方法比对照组诱导出了更多粘细菌子实体种类,采自4个地区的9份样品共分离纯化出40株粘细菌,按形态学和分子生物学,将其归类于原囊菌属(Archangium)、珊瑚菌属(Corallococcus)、软骨霉状菌属(Chondromyces)、粘球菌属(Myxococcus)、侏囊菌属(Nannocystis)、多囊菌属(Polyangium)、匣状球菌属(Pyxidicoccus)。【结论】与传统分离方法相比,添加土壤浸提液,诱导菌点接法能大大提高诱导出的粘细菌子实体种类的数目,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为诱导菌对子实体种类影响较小,但是也发现革兰氏阳性菌特异性诱导出的子实体。虽然本研究通过对分离培养基的改良大大增加了子实体种类,但是纯化出的粘细菌种类远少于观察到的子实体种类,说明除改良分离方法外,还需进一步研究粘细菌的纯化方法,提高分离所得粘细菌的多样性,获取更多粘细菌新资源。

关键词：粘细菌分离纯化子实体土壤浸提液诱导菌

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粘细菌分离方法探究

粘细菌分离方法探究

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作者：李维山东大学

学位级别：硕士

目前环境中超过99%的微生物仍然是不可培养的,这表明微生物资源潜力巨大。宏基因组测序技术的发展为我们提供了不依赖培养即可了解环境微生物的方法,但是基于培养的对微生物性状以及生理生化特性的研究,仍然是传统微生物分类依据,也是... 详细信息

目前环境中超过99%的微生物仍然是不可培养的,这表明微生物资源潜力巨大。宏基因组测序技术的发展为我们提供了不依赖培养即可了解环境微生物的方法,但是基于培养的对微生物性状以及生理生化特性的研究,仍然是传统微生物分类依据,也是将丰富微生物资源运用到生产实践中必不可少的方法。本文分析了目前关于新型微生物的分离方法,发现特定的分离方法只对环境中的特定微生物类群有效,换句话说,定向分离特定环境微生物要根据其特性设计针对性实验。就粘细菌而言,除了具有分布广、丰都高、代时长等特点外,还具有显著的社会性,如生长的细胞密度依赖,群体运动,群体捕食等。鉴于粘细菌的这些特点,本文设计了微球包埋结合粘细菌助长的体系,尝试对环境中未知粘细菌进行分离筛选。在本文的工作中,我们建立了低熔点琼脂糖微球包埋的制备方法,得到直径在50-70μm间的微球,并在微球中包埋单个细胞,包埋比例约为1：10。然后我们将制得的含有单细胞微球接种于由粘细菌作为助长菌的助长体系中,通过粘细菌间的相互促进作用,使球内的单细胞分裂为微菌落,再通过显微操作技术,直接选取成功获得微菌落的微球,进行后续测序及培养。在进行粘细菌间的包埋助长实验时,我们发现粘细菌间的确存在生长的相互促进作用,即被包埋的单个细胞在助长粘细菌的存在下可以分裂为菌落。这种促进作用在亲缘关系较近的粘细菌种群之间均可发生,且不依赖于接触。在进行土壤样品的包埋助长实验时,我们获得了约100株球内微菌落,但测序结果没有检测到粘细菌,推测由于土壤环境存在许多快速生长菌,导致生长缓慢的粘细菌在复杂环境中难以被发现。为了定向富集环境中的粘细菌,本文采用较为先进的拉曼技术尝试对环境中疑似粘细菌的杆状细胞进行富集后,在运用到包埋助长实验中。我们首先得到了6属13株不同粘细菌的拉曼光谱,通过与其它类群微生物比较,发现于1150cm-1及1503cm-1处存在粘细菌特有的条带,可以作为定向拉曼弹射环境疑似粘细菌的依据。我们共对约150个环境杆状细胞进行拉曼测试,得到10个含有1或2个特殊条带的细胞,经过单细胞基因组扩增和鉴定,结果显示没有检测到粘细菌,其中90%的细胞属于芽孢杆菌。因此在目前实验条件下,使用拉曼光谱和拉曼弹射技术对复杂环境(如土壤)中杆状细胞进行直接捕获的方法效率低,定向性差。但本文首次将拉曼光谱运用到复杂环境中进行特定微生物类群的分类与获取,这为研究者们探索新型微生物分离方法、甚至是新型微生物分类依据提供了思路。

关键词：粘细菌分离微球包埋粘细菌助长拉曼光谱

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