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粗糙型鼠伤寒沙门菌生物学特性与变异机制研究

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粗糙型鼠伤寒沙门菌生物学特性与变异机制研究

作者：张耀文郑州大学

学位级别：硕士

沙门菌(Salmonella)是一类重要的人畜共患病原菌,严重威胁人类的健康和畜牧业的发展,鼠伤寒沙门菌是沙门菌中分离率最高的血清型之一。鼠伤寒沙门菌自被报道以来菌落形态多为光滑型,仅有极少量菌落形态变异为粗糙型的报道[1]。本课题组... 详细信息

沙门菌(Salmonella)是一类重要的人畜共患病原菌,严重威胁人类的健康和畜牧业的发展,鼠伤寒沙门菌是沙门菌中分离率最高的血清型之一。鼠伤寒沙门菌自被报道以来菌落形态多为光滑型,仅有极少量菌落形态变异为粗糙型的报道[1]。本课题组在肠道病原监测过程中发现:近年来,我国鼠伤寒沙门菌中出现了大量菌落形态为粗糙型的菌株,测序数据分析显示这些菌株已形成为一个新的独立克隆,该克隆在我国多地均有流行,且已引起暴发疫情,具有潜在的严重的公共卫生威胁。目前,粗糙型鼠伤寒沙门菌的生物学特征和变异机制仍不清楚。本项目拟在前期工作基础上,深入系统地开展粗糙型鼠伤寒沙门菌的生物学特征研究,探究粗糙型鼠伤寒沙门菌变异机制,从而为我国乃至全球鼠伤寒沙门菌的危害评估及防控提供科学依据。目的1.阐明粗糙型鼠伤寒沙门菌的形态特征和生长特征,通过选择位于同一大进化分支的粗糙型菌株和光滑型菌株进行形态特征分析、不同酸碱、渗透压环境下的生长曲线特征分析,以及生物膜形成能力分析,探明粗糙型鼠伤寒沙门菌在不同环境条件下的生长特性。2.通过蛋白组学和代谢组学分析,阐明粗糙型菌株较光滑型菌株在蛋白质、代谢物上的表达差异,通过GO功能分析、KEGG通路分析等阐明粗糙型菌株较光滑型菌株在作用通路上的变化,为下一步研究粗糙型鼠伤寒沙门菌的变异机制打下基础。3.通过透射电镜观察、免疫印迹实验(Western-Blot,WB)、构建基因缺失株以及生物信息学分析等方法,验证两种表型菌株的主要成分差异,并挖掘产生粗糙型变异的关键机制。方法1.采用粗糙型诊断用软琼脂、刚果红纤维素培养基、以及扫描电镜来观察不同形态鼠伤寒沙门菌形态特征;通过实时微生物生长分析系统对其在不同PH条件和渗透压条件下的生长曲线进行测定;通过结晶紫染色法和激光共聚焦扫描显微镜法对其生物膜形成能力进行评估。2.采用DIA蛋白质组学对粗糙型和光滑型菌株的蛋白质产物进行鉴定,通过结构域分析和GO功能分析对差异蛋白质功能进行描述,通过KEGG通路分析找到主要差异蛋白质通路。3.采用UHPLC-MS对粗糙型和光滑型菌株的代谢产物进行鉴定,通过OPLS-DA筛选出显著性差异代谢物,通过KEGG通路分析找到主要差异代谢物通路。4.采用联合组学分析寻找差异蛋白和代谢物共同参与数目较多和富集显著的KEGG通路。5.通过WB实验验证不同形态菌株的鞭毛蛋白表达量差异;通过透射电镜观察不同形态菌株鞭毛含量和长度,通过构建csgD敲除株验证csgD是参与鼠伤寒沙门菌粗糙型变异的关键基因;通过生物信息学分析发现影响csgD基因表达水平的基因突变,揭示粗糙型菌株变异的关键机制。结果1.在沙门菌粗糙型诊断用软琼脂培养基上,粗糙型菌株呈现“煎鸡蛋”样特征,用接菌环挑起菌落边缘可将整个菌落带起,光滑型菌株则呈现出中心饱满、边缘光滑且规则的形态特征;在刚果红考马斯亮蓝培养基上,粗糙型菌株呈现出红色、干燥、粗糙的形态特征,光滑型菌株则呈现出棕色、光滑的形态特征;在全自动菌落实时培养计数站上观察发现,粗糙型菌株从对数期开始,其生长形态开始明显大于光滑型;扫描电镜观察发现,粗糙型菌株的菌体之间被大量丝状物质黏连和包裹在一起,光滑型菌株的菌体散在分布,菌体外仅有少量丝状物质存在;粗糙型菌株比光滑型菌株在酸(PH=5.5)、碱(PH=8.5)、低渗(NaCl=0.1%)环境下的生存能力更强、生物膜形成能力更强,提示粗糙型菌株面对环境胁迫时,具有更强的生存和适应能力。2.DIA差异蛋白质组学分析结果显示,粗糙型菌株相对于光滑型菌株差异表达倍数在三倍以上的蛋白主要包括:与菌毛和纤维素生成相关蛋白CsgD、CsgG、CsgE、CsgF,与鞭毛形成相关蛋白 FliD、FlgL、FlgK、FlgB、FlgC,与Ⅲ型分泌系统相关的毒力蛋白:SipD、SipC、SipA,粗糙型菌株相对于光滑型菌株差异表达倍数在十倍以上的蛋白主要包括:CsgD、CsgG、CsgE、FliD,其中CsgD差异表达倍数最高,达28.82倍;功能富集分析结果显示,鞭毛运动相关功能是差异蛋白富集最显著的功能;KEGG通路分析结果显示,在鞭毛通路、生物膜形成通路、趋化反应通路、双组分系统通路、ABC转运系统通路上差异表达蛋白数目较多,鞭毛通路是差异蛋白富集最显著的通路。3.非靶向差异代谢组学分析结果显示,粗糙型与光滑型菌株鉴定到的代谢物中有机酸及其衍生物类所占的比例最高;粗糙型相对于光滑性菌株差异表达显著上调三倍以上的代谢物主要包括:氨基酸类和肽类代谢物(肌酐、精氨酸和L-焦谷氨酸)、苯及其衍生物、喹啉及其衍生物、黄酮类化合物和有机氧化合物等,其中肌酐差异表达倍数最高,达96.17倍;KEGG通路分析结果显示,粗糙型与光滑型菌株在ABC转运通路、氨基酸生物合成通路上差异表达代谢物最多,ABC转运通路是差异代谢物富集最显著的通路。4.联合组学分析结果显示,蛋白质和代谢组学共同参与的KEGG通路有5

关键词：鼠伤寒沙门菌粗糙型生物学特征变异机制蛋白质组学代谢组学

伤寒沙门菌野生型与粗糙型菌体蛋白质的双向电泳分析与研究

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微生物学报 2006年第5期46卷 838-840页

作者：康颖倩王和贵阳医学院微生物学教研室贵阳550004

了解伤寒沙门菌野生型与粗糙型菌株的菌体蛋白质组成特点，探讨伤寒沙门菌粗糙型变异的遗传学基础。分离提取伤寒沙门菌野生型与粗糙型菌株的菌体蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）和考马斯亮蓝染色，计算机分析与比较两菌株... 详细信息

了解伤寒沙门菌野生型与粗糙型菌株的菌体蛋白质组成特点，探讨伤寒沙门菌粗糙型变异的遗传学基础。分离提取伤寒沙门菌野生型与粗糙型菌株的菌体蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）和考马斯亮蓝染色，计算机分析与比较两菌株的蛋白质组成特点及其相关性。伤寒沙门菌野生型与粗糙型具有相似的蛋白质电泳图谱，相似系数为78％。多数蛋白质斑点分布于pH3．0～6．4之间，并且分子量小于30kDa。两菌株的蛋白质电泳图谱之间的主要差异共计36处，多数差异蛋白质的分子量小于20kDa。伤寒沙门菌粗糙型与野生型菌体蛋白质组成的差异显示，粗糙型变异绝不仅仅是O抗原多糖的缺失，也可发生菌体蛋白质组成的改变与缺失。伤寒沙门菌粗糙型保留了同其亲代野生型菌株一致的绝大多数菌体蛋白质组成，在2D-PAGE中形成伤寒沙门菌特征性的基本蛋白质图谱，有助于对粗糙型菌株进行蛋白质分子同源性与变异性的分析与鉴别。

关键词： 2D-PAGE 伤寒沙门菌粗糙型蛋白质图谱

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一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定

中国畜牧兽医 2020年第11期47卷 3445-3453页

作者：孙浩杰任小侠秦玉明朱良全蒋卉孙石静丁家波辛凌翔王楠李晓宁李巧玲毛开荣蔡亚南徐磊中国兽医药品监察所国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室北京100081 吉林农业大学动物科学技术学院长春130118

本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存... 详细信息

本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示,试验成功获得了诱导突变株,其缺失片段大小为15070 bp;热凝集试验阳性,能被结晶紫染色,吖啶黄凝集试验阳性;对提取脂多糖进行银染,结果显示O链缺失,诱导株RB71脂多糖不完整;连续传代30次,PCR检测未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19;入侵RAW264.7细胞72 h时,其胞内存活率与亲本株相比极显著下降(P型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法,成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株,该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱,这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。

关键词：诱导粗糙型布鲁氏菌疫苗

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光滑型和粗糙型内毒素的差异

人民军医 1992年第4期35卷 75-77页

作者：何炬斌焦炳华 54440部队卫生队第二军医大学微生物学教研室

细菌内毒素是存在于革兰阴性菌和某些其他微生物如衣原体、立克次体、螺旋体等胞壁中的脂多糖(Lipopolysaccharidde,简称LPS)成分。LPS是一类特殊类型的磷脂,对哺乳类动物具有广泛的生物学作用。根据化学结构,可以将LPS分为二大类,即光... 详细信息

细菌内毒素是存在于革兰阴性菌和某些其他微生物如衣原体、立克次体、螺旋体等胞壁中的脂多糖(Lipopolysaccharidde,简称LPS)成分。LPS是一类特殊类型的磷脂,对哺乳类动物具有广泛的生物学作用。根据化学结构,可以将LPS分为二大类,即光滑型(Smooth Form LPS,S-LPS)和粗糙型LPS(Rough Form LPS,R-LPS)。这二类LPS在化学结构,实验室制备及生物学活性等方面具有显著差别。结构特征典型的S-LPS分子从结构上可分为三部分,

关键词：光滑型粗糙型内毒素衣原体立克次体

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四株羊种粗糙型布氏菌血清学试验报告

中国地方病防治 1990年第5期5卷 295-296页

作者：冬青崔庆禄孙志吴从雅内蒙古地方病防治研究所内蒙古地方病防治研究所呼和浩特

从哲盟地区收集到四株羊种粗糙型布氏菌,按布氏菌常规法分型鉴定与已往分离到的布氏菌特性有差异。为研究这几株菌的特性,进行了豚鼠试验,现将试验结果报道如下。

关键词：布氏菌虎红兽医药品批号粗糙型抗原布氏菌感染血清凝集试验试管凝集试验试验菌株细菌分离

放线共生放线杆菌粗糙型与光滑型菌落的主要外膜蛋白

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中国微生态学杂志 2002年第3期14卷 153-154页

作者：王者玲 DAISUKE Kato 大岛友子高尾亚由子前田伸子杨圣辉首都医科大学附属北京口腔医院北京100050 日本鹤见大学齿学部

目的 :观察放线共生放线杆菌粗糙型与光滑型菌株菌体蛋白表达上的差异。方法 :聚丙稀酰胺凝胶电泳观察两型细菌全细胞蛋白及超高速离心提取的细菌主要外膜蛋白差异。结果 :全细胞蛋白电泳两型细菌蛋白带无明显差异 ;提取的主要外膜蛋白... 详细信息

目的 :观察放线共生放线杆菌粗糙型与光滑型菌株菌体蛋白表达上的差异。方法 :聚丙稀酰胺凝胶电泳观察两型细菌全细胞蛋白及超高速离心提取的细菌主要外膜蛋白差异。结果 :全细胞蛋白电泳两型细菌蛋白带无明显差异 ;提取的主要外膜蛋白电泳粗糙型存在 18、2 9、4 5 k Da蛋白带 ,实验室参考菌株不存在 ,临床光滑型菌株存在少量。光滑型实验室参考菌株存在的蛋白带在所有实验菌株中均存在。结论 :18、2 9、4 5 k

关键词：放线共生放线杆菌粗糙型光滑型菌落外膜蛋白

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粗糙型布鲁氏菌血清的制备方法

中华地方病学杂志 1982年第1期 71-74页

作者：王庆禧杨莲芬姜顺求中国医学科学院流行病学微生物学研究所布病研究室

自绵羊副睾种布鲁氏菌、狗种布鲁氏菌和猪种布布鲁氏菌生物型5等粗糙型 (?) 鲁氏菌发现以来,不少研究者对粗糙型布鲁氏菌的分离培养和分种分型曾进行许多研究(2、4、10)。在研究中表明,粗糙型布鲁氏菌对单相特异性血清

关键词：布鲁氏菌绵羊狗种粗糙型血清制备方法

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含有大质粒的粗糙型宋内志贺氏菌的发现

中国生物制品学杂志 1988年第1期1卷 13-17,49页

作者：宋树珍陈锦荣曾(山仑) 王秉瑞卫生部兰州生物制品研究所

本文首次报导了一株粗糙型宋内氏菌(S_7R)中存在大质粒。试验证明,该大质粒远小于野生株中120Md 大小的 I 相质粒,只有64Md 左右,系源于有毒力的宋内志贺氏菌中的编码I相抗原及毒力的大质粒的自然缺失突变株。缺失的56Md 包含了负责编... 详细信息

本文首次报导了一株粗糙型宋内氏菌(S_7R)中存在大质粒。试验证明,该大质粒远小于野生株中120Md 大小的 I 相质粒,只有64Md 左右,系源于有毒力的宋内志贺氏菌中的编码I相抗原及毒力的大质粒的自然缺失突变株。缺失的56Md 包含了负责编码宋内氏菌毒力和 I 相抗原的部份,编码 I 相抗原的 DNA 片段估计不大于10Md,且与毒力编码区互不相关。S_7R 株的亲本株(S_7),其 I 相大质粒既不同于 S_7R,也不同于野生型。比 S_7R 约大10Md,能正常编码宋内氏 I 相抗原;但比起野生型减小了约46Md,这与 S_7株失去所有毒力表型有关,因而该 S_7株可安全地用作组建各类具有宋内氏 I 相抗原性的痢疾菌苗的供体。S_7R 中含有大质粒的达一发现,有助于宋内氏 I 相大质粒和 I 相抗原的遗传学研究。

关键词：光滑型粗糙型大质粒 I 相抗原

广西家畜及野生动物布鲁氏菌粗糙型和光滑型抗体水平检测

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广西医学 1989年第2期11卷 139-141页

作者：秦石英黄志雄陈英辉陆家华鲁翠芳广西壮族自治区卫生防疫站

自1985年以来,我们从全区38个市、县的家狗分离出60多株犬种布氏菌,证实了我区有犬种布氏菌存在和流行。为了进一步探讨广西犬种布氏菌病传染来源以及对家畜的危害程度,我们对疫区家畜及野生动物进行了犬种和普通光滑型布氏菌(S)血清学... 详细信息

自1985年以来,我们从全区38个市、县的家狗分离出60多株犬种布氏菌,证实了我区有犬种布氏菌存在和流行。为了进一步探讨广西犬种布氏菌病传染来源以及对家畜的危害程度,我们对疫区家畜及野生动物进行了犬种和普通光滑型布氏菌(S)血清学调查。发现在我区家畜和野生动物血清中,不仅存在着光滑型而且还存在粗糙型布氏菌(R)抗体,现将检测结果介绍如下,并对其流行病学意义进行初步阐述。材料与方法一、血清来源:采自全区38个重点市、县的家狗、奶牛、黄牛、水牛、猫、猪、兔、马、穿山甲、果子狸、梅花鹿、猴、鼠等13种不同种属的动物血清2411份。二、抗原:普通试管凝集抗原,由兰州生物制品研究所供给。

关键词：布氏菌病光滑型粗糙型试管凝集抗体滴度动物血清布氏菌抗体血清学调查流行病学意义布病