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粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

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中国人兽共患病学报 2016年第9期32卷 779-783,788页

作者：梁志林刘志刚邬玉兰陈思敏杨平常刘晓宇深圳大学过敏反应和免疫学研究所深圳518060

目的克隆表达粉尘螨13.8kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶E... 详细信息

目的克隆表达粉尘螨13.8kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性;clustalw2进行同源性分析,MEGA5工具包来构建系统进化树,ProtParam Tools预测其理化性质,PSIPRED预测其二级结构,SWISS-MODEL预测其三级结构。利用网络服务器IEDB内相关软件和Preprod,对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测。用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因,其开放阅读框396bp,编码131组氨基酸。将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白。该蛋白主要以可溶性形式存在,蛋白分子量约14kDa。间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合。测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96%。系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近。理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。结论成功克隆并表达了粉尘螨Bac,并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。

关键词：粉尘螨 13.8kDa溶菌酶(Bac) 原核表达免疫原性鉴定生物信息学分析

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粉尘螨铁蛋白的克隆、表达及蛋白特征分析

中国人兽共患病学报 2015年第10期31卷 927-930,937页

作者：林建立詹政科刘玉琳范小琴耿晓瑞刘晓宇深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060 南昌大学医学院免疫学教研室南昌330006 深圳大学耳鼻咽喉科研究所深圳518020

目的为了获得粉尘螨铁蛋白(ferritin)蛋白,并对该蛋白特征进行分析。方法根据铁蛋白基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白基因,PCR产物克隆入pET32a载体,构建的重组质粒pET32a-ferritin,经酶切和... 详细信息

目的为了获得粉尘螨铁蛋白(ferritin)蛋白,并对该蛋白特征进行分析。方法根据铁蛋白基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白基因,PCR产物克隆入pET32a载体,构建的重组质粒pET32a-ferritin,经酶切和测序鉴定后,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化其重组蛋白。用生物信息学方法对粉尘螨铁蛋白的特征进行分析。结果成功克隆粉尘螨铁蛋白基因并构建了pET32a-ferritin重组质粒;粉尘螨铁蛋白基因开放阅读框为543bp,编码179个氨基酸,PI 5.35;SDS-PAGE结果表明铁蛋白基因在大肠杆菌Bl21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,表达产物分子质量约为20kD。经生物信息学分析,粉尘螨铁蛋白含有8个丝氨酸激酶、7个苏氨酸激酶、7个酪氨酸激酶、0组氨酸激酶磷酸化位点,亲水区域大于疏水区域,属不稳定蛋白。结论克隆、表达了尘螨铁蛋白,经纯化后获得较高纯度的重组蛋白,并对其三级结构进行分析,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。

关键词：粉尘螨铁蛋白蛋白表达纯化生物信息学分析

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粉尘螨组分在过敏性哮喘发生过程中的作用

中国科学：生命科学 2018年第1期48卷 73-77页

作者：王辉刘晓宇李国平刘志刚深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060

哮喘是一种临床上常见的慢性呼吸道疾病,其特点是病人气道反复阻塞和喘息,过敏性哮喘是其最常见的形式[1].据统计,全世界哮喘的发病率高达5%~16%,在美国全年用于哮喘的治疗费用超过了AIDS和肺结核治疗费用的总和[2].我国约有哮喘患者300... 详细信息

哮喘是一种临床上常见的慢性呼吸道疾病,其特点是病人气道反复阻塞和喘息,过敏性哮喘是其最常见的形式[1].据统计,全世界哮喘的发病率高达5%~16%,在美国全年用于哮喘的治疗费用超过了AIDS和肺结核治疗费用的总和[2].我国约有哮喘患者3000万人,哮喘已经成为危害我国人民健康的重大疾病^（[3,4]）.在众多吸入性过敏原中,尘螨是诱发呼吸道过敏最重要的因素,约有80%左右的哮喘患者对尘螨敏感^（[5,6]）.

关键词：过敏性哮喘粉尘螨发生过程慢性呼吸道疾病组分 AIDS 人民健康发病率

粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶基因cDNA克隆和分子特征分析

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现代生物医学进展 2023年第20期23卷 3815-3819,3878页

作者：任雅宁周冬梅袁存银廖媛芬强士豪罗金丹崔玉宝南京医科大学附属无锡人民医院临床研究中心江苏无锡214001

目的:获取粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白(mitochondrial-like malate dehydrogenase,mMDH)的编码基因并了解其分子特征。方法:以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR扩增获得mMDH编码基因后、构建原核表达质粒,转化E.coil BL21(DE3)感受态... 详细信息

目的:获取粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白(mitochondrial-like malate dehydrogenase,mMDH)的编码基因并了解其分子特征。方法:以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR扩增获得mMDH编码基因后、构建原核表达质粒,转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定目的蛋白表达情况。采用NCBI、EXPASY在线生物信息学软件分析该基因编码蛋白质的生物学特征。结果:获得粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白的编码基因,全长1032bp。构建的原核表达质粒pET28a(+)-mMDH,经转化和诱导表达后,SDS-PAGE和Western Blot可见目的蛋白条带。该基因编码的蛋白质由343个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)36014.54Da,亚细胞定位主要在细胞质和细胞核,含有34个磷酸化位点(19个丝氨酸,12个苏氨酸和3个酪氨酸)。糖基化预测结果显示其含有2个N-糖基化位点(123位存在糖基化位点NASI和151位存在糖基化位点NSTV)和1个0-糖基化位点。二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。三维建模可观察到该蛋白为二聚体结构,CD-Search保守区域分析后显示其属于NADB-Rossmann家族,具有MDH-glyoxysomal-mitochondrial结构域。PyMol可视化后可在三维结构中观察到保守区域位点。将该基因推导出的氨基酸序列进行Blast获得同源基因,粉尘螨与屋尘螨、梅氏嗜霉螨进化关系较近,独成一簇。结论:获得粉尘螨线粒体样苹果酸脱氢酶蛋白的编码基因全长及其原核表达质粒,并对其生物学特征进行分析,为进一步探讨该基因的生理功能、开发尘螨控制措施奠定基础。

关键词：粉尘螨苹果酸脱氢酶基因克隆

粉尘螨壳聚糖纳米疫苗舌下含服对哮喘小鼠的治疗作用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第1期29卷 4-9页

作者：喻海琼刘志刚国华周一平深圳市福田人民医院深圳518033 深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所深圳518060

目的制备粉尘螨(Dermatophagoides farinae)壳聚糖纳米疫苗,并观察其免疫治疗哮喘小鼠的效果。方法采用离子凝胶法制备粉尘螨壳聚糖纳米疫苗。30只BALB/c小鼠随机均分为5组,阴性对照组(A组)用生理盐水处理,其余组用50μg粉尘螨粗提液+2m... 详细信息

目的制备粉尘螨(Dermatophagoides farinae)壳聚糖纳米疫苗,并观察其免疫治疗哮喘小鼠的效果。方法采用离子凝胶法制备粉尘螨壳聚糖纳米疫苗。30只BALB/c小鼠随机均分为5组,阴性对照组(A组)用生理盐水处理,其余组用50μg粉尘螨粗提液+2mg氢氧化铝腹腔注射致敏,第28天开始分别用PBS(B组,模型组)、空白壳聚糖(C组)、粉尘螨变应原(Der f)组(D组,1mg/次)和粉尘螨壳聚糖纳米疫苗(DCN)(E组,负荷1mg Der f的DCN/次)舌下含服免疫18次,每次间隔1d,末次免疫后1周用50μg粉尘螨变应原滴鼻激发,每天1次,连续7次。末次激发后24 h检测小鼠的气道高反应性;末次激发后48 h处死小鼠,取血,行肺泡灌洗,无菌摘取肺组织和脾脏;计数小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸粒细胞数,观察BALF和脾细胞上清中IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子水平,血清中IgE、IgA和IgG2a抗体水平;运用HE染色观察肺部炎症细胞的浸润程度,运用MTT法检测脾细胞的淋巴细胞增殖反应,计算刺激指数(SI)。结果与B组相比,D、E组气道高反应性和肺部病理改变减轻。D组(36.50×104/ml,3.72×104/ml)和E组(34.25×104/ml,2.25×104/ml)的BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞数显著少于B组(61.67×104/ml,14.17×104/ml)(P粉尘螨壳聚糖纳米疫苗对致敏小鼠具有免疫治疗作用。

关键词：粉尘螨壳聚糖纳米颗粒舌下含服疫苗免疫治疗

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丁香长效微乳液对粉尘螨成螨的杀灭效果研究

医学动物防制 2023年第7期39卷 629-633页

作者：赵聪岳治光宁晓冬王国春张文举胡旭阳尚振岗白若冰段心明河南安进生物技术股份有限公司新乡453519 河南应用技术职业学院辽宁省现代农业生产基地建设工程中心农发苑浙江农业发展有限公司

目的研究丁香长效微乳液对粉尘螨的杀灭效果及其最大作用时间,为尘螨防控提供科学依据。方法 2021年9月至2022年3月利用“熏蒸+触杀”法比较研究1.0、1.5、3.0、5.0、7.0、10.0和20.0mg/ml浓度丁香微乳液对粉尘螨的杀灭活性并计算其半... 详细信息

目的研究丁香长效微乳液对粉尘螨的杀灭效果及其最大作用时间,为尘螨防控提供科学依据。方法 2021年9月至2022年3月利用“熏蒸+触杀”法比较研究1.0、1.5、3.0、5.0、7.0、10.0和20.0mg/ml浓度丁香微乳液对粉尘螨的杀灭活性并计算其半数致死量(median lethal dosage, LD_(50))值;同时比较研究不同浓度、不同剂型丁香杀螨制剂与3种市售除螨液在9d内的杀螨效果。结果丁香微乳液对粉尘螨的LD_(50)为1.2mg/ml, LD_(50)在5.0mg/ml时可杀灭所有供试粉尘螨;有效成分含量0.5%、1.0%和3.0%的丁香长效微乳液在5d内的杀螨活性显著大于上述浓度同时间点的普通制剂组,与市售除螨液相比,有效成分含量1.0%的丁香长效微乳液在1~5d内对粉尘螨的平均杀灭率分别为100.0%(1d)、93.3%(2d)、73.3%(3d)、40.0%(4d)、28.3%(5d);有效成分含量3.0%的丁香长效微乳液在1~5d内对粉尘螨平均杀灭率分别为100.0%(1d)、100.0%(2d)、83.3%(3d)、53.3%(4d)、45.0%(5d),两者均高于同时间点的其他处理组。结论丁香长效微乳液在试验期间杀螨效果和最大作用时间均优于普通制剂组,有效成分含量1.0%、3.0%的丁香长效微乳液杀螨效果优于试验中的3种市售除螨液。

关键词：丁香微乳液粉尘螨长效体外杀螨活性植物杀螨

粉尘螨1类变应原T和B细胞表位t合基因的构建与表达

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中国血吸虫病防治杂志 2014年第4期26卷 420-424页

作者：徐海丰徐朋飞王克霞李朝品安徽理工大学医学院病原生物学教研室淮南232000

目的：构建粉尘螨1类变应原（Derf1）的T和B细胞表位嵌合基因原核表达载体。方法将Derf1包含的5个T细胞表位（T1～T5）和6个B细胞表位（B1～B6），以B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5连接方式直接合成表位嵌合基因，并分别命名为Derf1A和Derf1B。构建原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B，双酶切及测序验证的阳性克隆转化到E.coliBL21（DE3）后诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物后进行纯化，并进行Westernblotting鉴定。ELISA法检测嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合力。结果双酶切及测序结果表明，成功构建了原核表达重组质粒pET-28a（＋）-Derf1A和pET-28a（＋）-Derf1B；SDS-PAGE分析表明，Derf1A和Derf1B诱导并纯化成功，Westernblotting结果进一步证实纯化了Derf1A和Derf1B嵌合蛋白。与Derf1相比，Derf1A和Derf1B嵌合蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力显著降低（P均＜0.05），但Derf1A和Derf1B间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论成功表达了Derf1的T和B细胞表位嵌合蛋白，为粉尘螨过敏的特异性免疫治疗奠定了基础。

关键词：粉尘螨粉尘螨1类变应原 T细胞表位 B细胞表位免疫印迹试验

Th17细胞及其细胞因子白细胞介素-17在粉尘螨致敏哮喘小鼠中的变化

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第2期33卷 127-129页

作者：吕勤杨小猛肖小军陈思杨平常刘志刚张敏深圳大学第一附属医院呼吸内科深圳518037 深圳大学过敏反应和免疫学研究所深圳518060

目的探讨Th17细胞及其细胞因子白细胞介素-17(IL-17)在粉尘螨致敏哮喘小鼠中的变化及其意义。方法 20只BALB/c小鼠随机均分为哮喘组和健康对照组。哮喘组小鼠于第0、7和14天每鼠腹腔注射200μl致敏液[含粉尘螨粗浸液提取物50μg,Al(OH)3... 详细信息

目的探讨Th17细胞及其细胞因子白细胞介素-17(IL-17)在粉尘螨致敏哮喘小鼠中的变化及其意义。方法 20只BALB/c小鼠随机均分为哮喘组和健康对照组。哮喘组小鼠于第0、7和14天每鼠腹腔注射200μl致敏液[含粉尘螨粗浸液提取物50μg,Al(OH)32 mg]致敏。末次免疫后1周采用粉尘螨粗浸液提取物连续进行滴鼻激发,每天1次,每次50μg,激发7次,健康对照组给予等体积的PBS[含Al(OH)32 mg]处理。末次激发后24 h内处死小鼠,取血清和肺泡灌洗液,无菌取脾脏。ELISA检测血清中Ig G1、Ig E和肺泡灌洗液中IL-17的含量;流式细胞仪检测脾脏中Th17细胞百分率。结果哮喘组小鼠血清中Ig G1和Ig E水平分别为(0.10±0.01)pg/ml和(1.15±0.10)pg/ml,高于健康对照组的(0.06±0.01)pg/ml和(0.04±0.01)pg/ml(P粉尘螨致敏哮喘小鼠较健康小鼠肺泡灌洗液IL-17水平和脾脏Th17细胞数量均升高。

关键词：哮喘粉尘螨 Th17 白细胞介素-17 小鼠

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6种精油微乳液对粉尘螨成螨的杀灭活性研究

医学动物防制 2023年第6期39卷 526-529页

作者：岳治光赵聪宁晓冬王国春张文举胡旭阳尚振岗白若冰李欣河南安进生物工程有限公司新乡453519 河南应用技术职业学院辽宁省现代农业生产基地建设工程中心河南省鹿邑县畜牧发展服务中心

目的分析丁香、肉桂、茶树、尤加利、香茅、天竺葵精油微乳液对粉尘螨成螨的杀灭活性,为尘螨防控提供科学依据。方法采用滤纸片“熏蒸+触杀”方式测定上述6种精油微乳液在不同浓度和作用时间对粉尘螨的杀灭活性,以及在封闭和开放系统下... 详细信息

目的分析丁香、肉桂、茶树、尤加利、香茅、天竺葵精油微乳液对粉尘螨成螨的杀灭活性,为尘螨防控提供科学依据。方法采用滤纸片“熏蒸+触杀”方式测定上述6种精油微乳液在不同浓度和作用时间对粉尘螨的杀灭活性,以及在封闭和开放系统下对粉尘螨成螨的杀灭效果。采用SPSS 22.0绘制和计算不同浓度精油微乳液的毒力回归曲线和半数致死量(lethal dose,LD50)值,邓肯氏新复极差多重比较法进行差异显著性分析。结果上述6种精油微乳液的LD50值分别为4.06、4.92、7.37、15.38、10.38和15.31μg/cm^(2),丁香精油可以在3h内杀灭所有供试粉尘螨,与氯氰菊酯组接近,杀螨率显著高于苯甲酸苄酯,差异有统计学意义(F=14.286,P=0.019)。不同浓度精油实验组在封闭系统的杀螨率均为100.00%,在开放系统的杀螨率均出现不同程度降低。结论6种精油微乳液,丁香精油微乳液、肉桂精油微乳液和茶树精油微乳液对粉尘螨成螨有很好的杀灭效果,呈剂量依赖性,除螨效果与作用时间和作用方式密切相关。

关键词：精油丁香茶树肉桂粉尘螨微乳液杀螨活性