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粉尘螨过敏原β-己糖胺酶的表达、纯化和生物信息学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第2期33卷 159-160,F0003页

作者：莫丽华刘玉琳杨利桃范小琴刘志刚杨平常深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060 南昌大学医学院免疫学教研室南昌330006 深圳大学耳鼻咽喉科研究所深圳518020

合成粉尘螨β-己糖胺酶基因并连接至p ET-28a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组β-己糖胺酶蛋白。通过生物信息学软件分析粉尘螨β-己糖胺酶蛋白基本特性。表达菌经诱导后,高效表达出β-己糖胺酶蛋白,SDS-PAGE结果显... 详细信息

合成粉尘螨β-己糖胺酶基因并连接至p ET-28a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组β-己糖胺酶蛋白。通过生物信息学软件分析粉尘螨β-己糖胺酶蛋白基本特性。表达菌经诱导后,高效表达出β-己糖胺酶蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量(Mr)约为55 000。粉尘螨β-己糖胺酶基因序列全长1 410 bp,编码469个氨基酸,位于胞外,无信号肽,属亲水性蛋白,其二级结构由14.71%的片层,30.70%的螺旋和54.58%的环组成。

关键词：粉尘螨 &beta -己糖胺酶原核表达

粉尘螨Derf2蛋白抑制Foxp3对小鼠弥漫大B细胞淋巴瘤的影响

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现代免疫学 2017年第6期37卷 500-504页

作者：章敬成钟俊武贾永清胡慧仙金华市中心医院血液科金华321000

探讨粉尘螨重组Derf2蛋白对小鼠Treg及特异性标记Foxp3蛋白的干扰作用,从而为粉尘螨抗原治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)提供基础实验支持。通过免疫组化检测Foxp3蛋白在DLBCL患者淋巴结石蜡标本中的表达,... 详细信息

探讨粉尘螨重组Derf2蛋白对小鼠Treg及特异性标记Foxp3蛋白的干扰作用,从而为粉尘螨抗原治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)提供基础实验支持。通过免疫组化检测Foxp3蛋白在DLBCL患者淋巴结石蜡标本中的表达,利用临床数据对Foxp3蛋白在DLBCL的表达与预后情况进行分析。提取粉尘螨重组Derf2蛋白对A20细胞进行干预,检测A20细胞内Foxp3蛋白表达及对细胞增殖能力的影响。建立小鼠DLBCL成瘤动物模型,对模型鼠注射粉尘螨相关抗原,对比各组动物模型的成瘤时间、成瘤速度及成瘤体积。结果显示,免疫组化检测Foxp3蛋白在DLBCL中的表达,发现瘤组织中Foxp3蛋白表达高于瘤旁组织(P粉尘螨抗原的小鼠成瘤速度及体积明显下降(P粉尘螨Derf2对肿瘤Foxp3蛋白的表达能起干扰作用,并抑制体内肿瘤的生长。

关键词：粉尘螨 Derf2蛋白 Foxp3 弥漫大B细胞淋巴瘤

粉尘螨过敏原Der f 32的克隆、表达、免疫学鉴定及其对树突状细胞的调节作用研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第3期37卷 279-285页

作者：江贝肖小军欧阳春艳罗新萍孙宝清李靖刘志刚深圳大学生命与海洋科学学院深圳518055 深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518055 广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室广州510120 广州医科大学第一附属医院广州510120

目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定其免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SD... 详细信息

目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定其免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)、临床皮肤点刺实验检测重组蛋白的免疫原性。将重组蛋白Der f 32与小鼠来源的DC2.4共培养24 h,设阳性对照组(加等量重组蛋白Der f 1)和阴性对照组(加等量PBS),流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD40、 CD83和CD80)的表达。将重组蛋白稀释为10、 20、 30、 40、 50、 60μg/ml等不同浓度,分别与DC2.4共培养48 h后, Western blotting分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白4 (TIM4)的表达情况。结果SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Der f 32相对分子质量(Mr)约35 000。临床皮肤点刺实验表明, 42位尘螨过敏患者中有6例对重组蛋白Der f 32过敏,阳性率为14.2%。Western blotting结果显示,重组蛋白Der f 32能与皮试阳性患者血清IgE抗体特异性结合。流式细胞术检测结果显示,重组蛋白Der f 32与DC2.4共培养后, CD40、 CD83、 CD80的表达水平分别为24.5%、 9.6%和24.6%,高于阴性对照组(11.9%、 3.1%和15.6%)(P 粉尘螨新过敏原Der f 32,该蛋白能促进DC表面分子和TIM4的表达。

关键词：粉尘螨 Der f 32 免疫原性树突状细胞

粉尘螨聚泛素样蛋白基因克隆、表达与生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2021年第8期16卷 922-926页

作者：李青青潘瑞琳周鹰袁存银崔玉宝南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科江苏无锡214023 南京医科大学附属无锡儿童医院儿科实验室

目的克隆、表达粉尘螨聚泛素样蛋白(polyubiquitin, poly-u)的编码基因全长并制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和分析。方法根据转录组测序及其功能注释结果,以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR和RACE技术获得全长基因后构建原核表... 详细信息

目的克隆、表达粉尘螨聚泛素样蛋白(polyubiquitin, poly-u)的编码基因全长并制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和分析。方法根据转录组测序及其功能注释结果,以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR和RACE技术获得全长基因后构建原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)T1R感受态细胞中,利用异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。采用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的生物学特征。结果获得了粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因,全长1 644 bp,构建的原核表达质粒pET28a(+)-poly-u转化BL21后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定均可见目的蛋白条带。生物信息学分析该基因编码的蛋白质由547个氨基酸组成,相对分子质量为61.3×10^(3)。预测二级结构包括α-螺旋(占32.54%)、延伸主链(占15.36%)和无规卷曲(占52.10%),优势表位可能为TGGQQMGR、LEDRRTL、IQDKEQIPPDQ。结论成功获得粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因全长及其原核表达质粒,,并对其生物学特征进行了分析,为进一步针对该基因开发尘螨防制措施奠定了基础。

关键词：粉尘螨尘螨生物信息学基因克隆泛素多聚泛素

2,4-二硝基氟苯和粉尘螨诱导的特应性皮炎样小鼠模型皮损中固有淋巴样细胞的变化

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免疫学杂志 2022年第12期38卷 1038-1045页

作者：冯树晶王宇高翠娥刘文英宋志强陆军军医大学西南医院皮肤科重庆400038 陆军军医大学高原军事医学系病理生理学教研室重庆400038 西南大学医学研究院重庆400715

目的本研究以半抗原和过敏原建立特应性皮炎(AD)样小鼠模型,并初步观察固有淋巴样细胞的数量和表面标志。方法将2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)和粉尘螨(dermatophagoides farina, DfE)提取物交替涂擦于Balb/c小鼠... 详细信息

目的本研究以半抗原和过敏原建立特应性皮炎(AD)样小鼠模型,并初步观察固有淋巴样细胞的数量和表面标志。方法将2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)和粉尘螨(dermatophagoides farina, DfE)提取物交替涂擦于Balb/c小鼠的背部皮肤8周。记录小鼠皮损临床特征,观察固有淋巴样细胞的变化。结果致敏小鼠背部出现严重的红斑、糜烂和表皮剥落,Th2型免疫反应因子在皮损中升高,具有典型特应性皮炎临床特征。模型组皮损中总固有淋巴样细胞数量显著升高,分泌IL-10的类调节型固有淋巴细胞数量显著降低。II型固有淋巴细胞(typy two innate lymphoid cells, ILC2s)在模型小鼠皮肤中数量显著升高,激活的ILC2细胞数量增多。在模型组与对照组小鼠脾中,ILC2细胞数量、激活标志以及胞内炎症因子IL-12、IL-13无明显差异。结论 DNFB和粉尘螨提取物能够诱导特应性皮炎样皮损,总固有淋巴样细胞在皮损中显著增加,激活的ILC2细胞在皮损中显著增加。该研究对于深入了解半抗原和变应原同时致敏的AD样小鼠模型病理机制具有参考价值。

关键词：特应性皮炎 2 4-二硝基氟苯粉尘螨 Balb/c小鼠固有淋巴样细胞

粉尘螨变应原第5组分单克隆抗体的制备与鉴定

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现代免疫学 2018年第1期38卷 8-12页

作者：李启松孙金霞杨李马桂芳张承伯俞黎黎崔玉宝江苏医药职业学院盐城224005 盐城市亭湖区南洋镇卫生院盐城224106 无锡市人民医院(南京医科大学附属无锡人民医院)中心实验室无锡214023

本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。将质粒pET28a(+)-Der f 5转化ArcticExpress(DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白。利用Der f 5重组... 详细信息

本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。将质粒pET28a(+)-Der f 5转化ArcticExpress(DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白。利用Der f 5重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏细胞与其骨髓瘤细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌抗体的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。最终获得3株稳定分泌鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的高效价单克隆抗体。研究分析表明该3株单抗均能识别重组Der f 5蛋白和天然的粉尘螨提取物。本实验成功制备了3株鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der f 5检测及纯化方法奠定了基础。

关键词： Der f 5 粉尘螨单克隆抗体特性鉴定

粉尘螨诱导建立“特应性皮炎-哮喘”小鼠模型

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中国皮肤性病学杂志 2018年第3期32卷 275-280页

作者：窦侠刘小明李子卓张雅瑞张杰董小林张伟北京大学深圳医院广东深圳518036 深圳北京大学香港科技大学医学中心广东深圳518036

目的建立粉尘螨变应原经皮致敏、滴鼻激发诱发的"特应性皮炎-哮喘"小鼠模型。方法以C57BL/6J小鼠为研究对象,通过反复破坏皮肤屏障后贴敷粉尘螨变应原经皮致敏、然后给予粉尘螨滴鼻激发气道炎症的方法制备特应性皮炎-哮喘小鼠模型,并从... 详细信息

目的建立粉尘螨变应原经皮致敏、滴鼻激发诱发的"特应性皮炎-哮喘"小鼠模型。方法以C57BL/6J小鼠为研究对象,通过反复破坏皮肤屏障后贴敷粉尘螨变应原经皮致敏、然后给予粉尘螨滴鼻激发气道炎症的方法制备特应性皮炎-哮喘小鼠模型,并从皮肤及肺组织病理、免疫炎症分子定量表达、支气管肺泡灌洗液中炎症细胞计数以及气道高反应性检测等不同方面对小鼠模型进行评估。结果模型小鼠致敏处皮肤组织病理呈典型的湿疹样改变,皮损中Th2型细胞因子表达显著升高,Th1型细胞因子表达与对照差异无统计学意义。模型小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数显著增多,其中淋巴细胞和嗜酸细胞数量显著高于对照组。肺组织病理可见支气管周围明显的嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润,肺组织中Th2型细胞因子表达也显著升高。模型小鼠经气道吸入甲酰胆碱后肺阻力随甲酰胆碱浓度升高而显著增加,肺动态顺应性则显著下降。结论成功建立粉尘螨变应原经皮致敏诱导的"特应性皮炎-哮喘"动物模型,为特应性进程发病机制的研究提供了方法。

关键词：特应性皮炎哮喘粉尘螨特应性进程动物模型

粉尘螨Ⅲ类重组变应原对哮喘小鼠免疫治疗的效果

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第4期32卷 280-284页

作者：李娜姜玉新刁吉东赵蓓蓓李朝品皖南医学院寄生虫学教研室芜湖241002 皖南医学院生理学教研室芜湖241002

目的探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原（rDer f 3）对过敏性哮喘小鼠的免疫治疗效果。方法随机将40只BALB/c小鼠均分为4组,哮喘组、免疫治疗组、卵清蛋白（OVA）组和PBS组,分别在第0、第7和第14天哮喘组和免疫治疗组每鼠经腹腔注射100μl致... 详细信息

目的探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原（rDer f 3）对过敏性哮喘小鼠的免疫治疗效果。方法随机将40只BALB/c小鼠均分为4组,哮喘组、免疫治疗组、卵清蛋白（OVA）组和PBS组,分别在第0、第7和第14天哮喘组和免疫治疗组每鼠经腹腔注射100μl致敏液（含rDer f 3 10μg）;卵清蛋白组每鼠经腹腔注射100μl致敏液（含OVA 10μg）;PBS组则以PBS代替致敏液。第21天起,哮喘组和免疫治疗组小鼠用rDer f 3进行滴鼻激发试验,连续7 d,免疫治疗组小鼠在第25～27天滴鼻激发前30 min,用100μg rDer f 3纯化蛋白皮下注射进行特异性免疫治疗。PBS组和卵清蛋白组则分别用PBS和OVA进行滴鼻激发和腹腔注射,最后1次滴鼻激发24 h后脱臼处死小鼠。收集各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞和嗜酸粒细胞计数;对肺组织病理切片进行HE染色,镜下观察肺组织炎症细胞浸润情况。ELISA检测BALF和脾细胞培养上清（SSCS）中白细胞介素-5（IL-5）和γ干扰素（IFN-γ）及血清中变应原特异性IgE、IgG2a抗体水平。结果肺组织病理切片结果显示,免疫治疗组小鼠炎症反应明显减轻。小鼠BALF中白细胞总数在免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组分别为（7.03±1.38）×108/ml、（22.11±3.70）×108/ml和（22.75±3.24）×108/ml,免疫治疗组低于卵清蛋白组和哮喘组（P〈0.01）,嗜酸粒细胞的变化趋势与白细胞类似。免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组BALF中IL-5的水平分别为（108.20±11.02）pg/ml、（182.04±13.94）pg/ml和（195.33±15.33）pg/ml,SSCS中IL-5的水平分别为（98.34±13.06）pg/ml、（208.26±10.63）pg/ml和（179.54±13.65）pg/ml,免疫治疗组均明显低于卵清蛋白组和哮喘组（P〈0.01）。而IFN-γ含量则高于卵清蛋白组和哮喘组（P〈0.01）。IgE水平免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组分别为（9.12±3.78）IU/ml、（26.87±4.30）IU/ml和（35.25±8.84）IU/ml,与卵清蛋白组和哮喘组相比,免疫治疗组明显降低（P〈0.01）,而IgG2a水平（38.52±6.33）μg/ml则显著升高（P〈0.01）。结论粉尘螨Ⅲ类变应原可逆转哮喘小鼠的变态反应性气道及肺部炎症。

关键词：粉尘螨 Der f3 变应原哮喘免疫治疗

粉尘螨变应原第7组分(Der f 7)重组蛋白单克隆抗体的制备

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中国免疫学杂志 2017年第7期33卷 1039-1042页

作者：孙金霞俞黎黎滕飞翔杨李崔玉宝盐城卫生职业技术学院医学技术学院盐城224005 东南大学医学院附属盐城医院中心实验室盐城224001

目的:克隆表达粉尘螨变应原第7组分(简称Der f 7)重组蛋白,制备抗Der f 7单克隆抗体,并进行鉴定。方法:用p ET28a(+)-Der f 7原核表达体系表达Der f 7重组蛋白,以此免疫BALB/c小鼠,将骨髓瘤细胞和脾细胞融合,经ELISA法筛选杂交瘤细胞。... 详细信息

目的:克隆表达粉尘螨变应原第7组分(简称Der f 7)重组蛋白,制备抗Der f 7单克隆抗体,并进行鉴定。方法:用p ET28a(+)-Der f 7原核表达体系表达Der f 7重组蛋白,以此免疫BALB/c小鼠,将骨髓瘤细胞和脾细胞融合,经ELISA法筛选杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔,获得腹水,经蛋白A琼脂糖介质纯化,后鉴定抗体的效价、纯度,采用免疫印迹法鉴定抗体的特异性。结果:获得三株稳定分泌重组Der f 7单克隆抗体的杂交瘤细胞,产生的抗体纯度高,效价高于1∶243 000。Western blot显示能很好地识别Der f 7重组蛋白。为Der f 7变应原的定量、定位及相关过敏性疾病的诊疗奠定基础。结论:成功获得粉尘螨变应原第7组分(Der f7)重组蛋白单克隆抗体,且抗体效价纯度及特异性较好。

关键词： Der f 7 单克隆抗体粉尘螨变应原