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屋尘螨和粉尘螨主要变应原的序列多态性分析

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第1期26卷 37-41页

作者：张纯青 Peter B.Thorsted Kaare Lund Michael D.Spangfort 徐军钟南山姜勇南方医科大学病理生理学教研室丹麦ALK-Abelló公司研究部

目的探讨不同地域间屋尘螨和粉尘螨主要变应原变异体的差异。方法分别提取中国华南地区培养的粉尘螨和欧洲商业化培养的屋尘螨和粉尘螨的螨体、螨卵和全螨培养物总RNA,采用RT-PCR技术扩增第1组变应原的包含前导肽段、酶原肽段和成熟肽段... 详细信息

目的探讨不同地域间屋尘螨和粉尘螨主要变应原变异体的差异。方法分别提取中国华南地区培养的粉尘螨和欧洲商业化培养的屋尘螨和粉尘螨的螨体、螨卵和全螨培养物总RNA,采用RT-PCR技术扩增第1组变应原的包含前导肽段、酶原肽段和成熟肽段,以及第2组变应原的包含前导肽段和成熟肽段的目的片段,根据国际标准参照物进行序列比较。结果欧洲商业化的屋尘螨Derp1主要变异体是Derp1.0105,除了第124V、50Y和19M位氨基酸有频繁的置换外,其余为散在的置换,出现8种新的变异体;Derp2主要变异体是Derp2.0104,置换集中在第40V、4T7、111M和114D位,出现6种新的变异体。中国华南地区的粉尘螨Derf1变异体很少,出现3种新的变异体;与欧洲商业化的粉尘螨相比,中国华南地区有不同的Derf2变异体,出现6种新的变异体。来自螨体、螨卵和全螨培养物的各主要变应原变异体无明显差异。结论不同地域间尘螨的主要变异体不同。

关键词：屋尘螨粉尘螨变应原多态性

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粉尘螨脂质体的制备及稳定性考察

沈阳药科大学学报 2009年第10期26卷 771-774页

作者：岳文燕周书林陈文魁绍兴文理学院医学院浙江绍兴312000 皖南医学院安徽芜湖241000

目的研究冻融法对粉尘螨(Dermatophagoides farinae,DF)脂质体包封率、形态及稳定性影响。方法采用逆向蒸发法制备粉尘螨脂质体悬液,冰冻高速离心法分离脂质体,透射电镜观察脂质体形态。-20℃低温冰箱冰冻,室温融化,反复5次,测定冻融前... 详细信息

目的研究冻融法对粉尘螨(Dermatophagoides farinae,DF)脂质体包封率、形态及稳定性影响。方法采用逆向蒸发法制备粉尘螨脂质体悬液,冰冻高速离心法分离脂质体,透射电镜观察脂质体形态。-20℃低温冰箱冰冻,室温融化,反复5次,测定冻融前后脂质体包封率及形态变化,并用离心加速实验测定脂质体稳定性变化。结果经冻融法处理的脂质体包封率明显提高,可达(88.52±0.87)%;在一定范围内包封率随冻融次数的增加而略有增大;经离心加速实验进一步验证了冻融法可使脂质体稳定性提高。结论冻融法为一有效的脂质体制备方法。

关键词：粉尘螨脂质体冻融法包封率稳定性

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粉尘螨2型变应原抗原定位的研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第1期25卷 49-52页

作者：李盟包莹刘志刚深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060

目的研究粉尘螨主要变应原Der f 2在螨体内的定位。方法采用免疫荧光抗原定位观察。先制备Der f 2单克隆抗体,再制作粉尘螨石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水,入3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗后依次加入单克隆抗体血清37℃孵育1 h... 详细信息

目的研究粉尘螨主要变应原Der f 2在螨体内的定位。方法采用免疫荧光抗原定位观察。先制备Der f 2单克隆抗体,再制作粉尘螨石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水,入3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗后依次加入单克隆抗体血清37℃孵育1 h、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶100)室温孵育60 min、抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶-异硫氰酸荧光素复合物(SABC-FITC)(1∶100)室温孵育60 min。PBS漂洗,伊文氏蓝处理切片5min,最后丙三醇封片。用抗重组Der f2单克隆抗体作一抗孵育,再选用抗鼠IgG荧光抗体为二抗,经荧光染色,观察Der f2在螨体内的位置。用正常小鼠血清(1∶100)代替小鼠单克隆抗体血清作为阴性对照。结果粉尘螨Der f2在中肠组织(包括中肠和后肠)和肠内容物均显示较强阳性,特别是肠内容物更明显。结论Der f 2分布于粉尘螨的中肠组织及其肠内容物。

关键词：粉尘螨变应原抗原定位

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粉尘螨滴剂治疗过敏性结膜炎42例

实用医学杂志 2009年第15期25卷 2543-2545页

作者：刘红梅钟凤如叶卫东熊雪蓉刘霞陈丽霞邝见娉梁美景广东省东莞市寮步医院 523400

目的:评估舌下特异性免疫治疗药物粉尘螨滴剂治疗过敏性结膜炎的疗效和安全性。方法:选择皮肤点刺检测结果为对尘螨过敏的4.5～42岁的各种类型结膜炎患者42例,进行为期2年的舌下特异性免疫治疗,并对他们治疗前后的结膜炎症状、体征和用... 详细信息

目的:评估舌下特异性免疫治疗药物粉尘螨滴剂治疗过敏性结膜炎的疗效和安全性。方法:选择皮肤点刺检测结果为对尘螨过敏的4.5～42岁的各种类型结膜炎患者42例,进行为期2年的舌下特异性免疫治疗,并对他们治疗前后的结膜炎症状、体征和用药量进行评分与比较。结果:共有31例患者(73.8%)完成1年的治疗,19例患者(45.2%)完成了2年的疗程。治疗前后患者的结膜炎症状、体征评分都显著降低,对组胺药物的使用量也明显减少,前后差异具有极显著的统计学意义(P粉尘螨滴剂是治疗过敏性结膜炎安全、有效的药物。

关键词：结膜炎舌下特异性免疫治疗粉尘螨

粉尘螨过敏原Der f 13基因克隆表达与免疫原性鉴定

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南昌大学学报（医学版） 2016年第1期56卷 21-25页

作者：王媛媛林建立黄娜娜巴金戈刘志刚刘晓宇深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所广东深圳518060

目的克隆表达粉尘螨过敏原Der f 13,并鉴定其免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,通过RT-PCR获得Der f 13的cDNA片段。根据已知Der f 13序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到T载体上并转入克隆菌Top 10... 详细信息

目的克隆表达粉尘螨过敏原Der f 13,并鉴定其免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,通过RT-PCR获得Der f 13的cDNA片段。根据已知Der f 13序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到T载体上并转入克隆菌Top 10中,涂板、培养,挑选阳性菌落,LB/AMP培养送测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,表达Derf 13蛋白,纯化、鉴定所得蛋白,并通过Western-blot等方法检测其免疫学活性。结果 RT-PCR结果显示,Der f 13基因片段大小为410 bp;同源性分析表明:本实验所克隆的Der f 13基因与NCBI数据库的Der f 13基因的同源性为95%;SDS-PAGE结果显示,重组质粒PET32-Der f 13在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白分子质量为35 ku,表达后的重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,经与尘螨过敏患者血清反应,检测出重组蛋白有较强免疫学活性。结论克隆出Der f 13基因,表达和纯化出目的蛋白,并具有免疫原性,为过敏性疾病的诊断和免疫治疗奠定理论基础。

关键词：粉尘螨过敏原 Derf 13 蛋白表达纯化免疫原性

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医用空气过滤装置对粉尘螨杀灭的实验研究

江西师范大学学报（自然科学版） 2017年第3期41卷 238-241页

作者：甄辉杨冠东杜少平肖小军刘志刚浙江省医疗器械研究所浙江杭州310009 广州工业微生物检测中心广东广州51066 深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所广东深圳518060

为探讨医用空气过滤装置对粉尘螨杀灭效果及降低空气中尘螨过敏原含量的影响,挑取粉尘螨成虫放置在空气过滤装置中,按不同时间段(0,12,24,48,72,96 h)分组,每组200只粉尘螨,处理后采取样本进行杀螨率检测及扫描电镜观察;采用抗原雾化法... 详细信息

为探讨医用空气过滤装置对粉尘螨杀灭效果及降低空气中尘螨过敏原含量的影响,挑取粉尘螨成虫放置在空气过滤装置中,按不同时间段(0,12,24,48,72,96 h)分组,每组200只粉尘螨,处理后采取样本进行杀螨率检测及扫描电镜观察;采用抗原雾化法检测,收集空气过滤装置处理的1 h样品,并通过双抗体夹心法检测样品中抗原含量.结果表明:空气净化装置处理后尘螨死亡率随着作用时间的延长而逐渐升高,在72 h和96 h,尘螨死亡率分别达到60.5%和92.5%;处理后的死螨严重脱水,虫体形态高度皱缩.医用空气过滤装置对空气中粉尘螨主要抗原Der f 1和Der f 2具有显著降低作用.

关键词：医用空气过滤装置粉尘螨杀螨过敏原 Der f

舌下含服粉尘螨变应原滴剂对变应性鼻炎患者血清中sIgE、sIgG4的影响及临床疗效观察

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广东医学 2017年第11期38卷 1737-1739页

作者：刘永平曾丽萍陶爱林赖荷刘雪婷广州医科大学附属第二医院过敏反应科广东广州510260 广东省过敏反应与免疫重点实验室广东广州510260

目的比较舌下含服标准化粉尘螨变应原滴剂治疗尘螨过敏的变应性鼻炎患者的临床效果及患者血清s Ig E和s Ig G4的变化,并比较不同年龄和不同性别组之间的疗效差异。方法采用自身对照方法分析54例舌下含服粉尘螨变应原滴剂的变应性鼻炎患... 详细信息

目的比较舌下含服标准化粉尘螨变应原滴剂治疗尘螨过敏的变应性鼻炎患者的临床效果及患者血清s Ig E和s Ig G4的变化,并比较不同年龄和不同性别组之间的疗效差异。方法采用自身对照方法分析54例舌下含服粉尘螨变应原滴剂的变应性鼻炎患者治疗52周前后免疫学指标s Ig E、s Ig G4及症状评分、体征评分、VAS评分的变化。结果舌下特异性免疫治疗疗效显著,治疗后患者症状评分、体征评分、VAS评分、患者血清s Ig E均显著下降(P0.05)。结论三项评分及血清特异性slg E和s Ig G4变化结果均提示粉尘螨变应原滴剂治疗变应性鼻炎疗效明显。舌下含服标准化粉尘螨变应原滴剂对不同年龄及不同性别的患者都有疗效。

关键词：舌下特异性免疫治疗粉尘螨变应性鼻炎 sIgE sIgG4

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粉尘螨不同地理种群的遗传结构研究

安徽工程大学学报 2019年第4期34卷 19-23,29页

作者：叶长江陈成郑凌霄刘啸陶香林杨邦和孙恩涛皖南医学院检验学院安徽芜湖241002 皖南医学院临床医学院安徽芜湖241002

对粉尘螨不同地理种群进行种群遗传多样性和遗传结构分析,为制定有效的防治粉尘螨策略提供种群分子遗传学方面的依据。根据中国动物地理区划进行储藏物粉螨样品采集工作,应用系统地理学的分析方法,以线粒体COI基因序列为分子标记,分析... 详细信息

对粉尘螨不同地理种群进行种群遗传多样性和遗传结构分析,为制定有效的防治粉尘螨策略提供种群分子遗传学方面的依据。根据中国动物地理区划进行储藏物粉螨样品采集工作,应用系统地理学的分析方法,以线粒体COI基因序列为分子标记,分析粉尘螨不同地理种群的遗传多样性和种群遗传分化。扩增了2017年采集自中国3个省4个地理种群的37个粉尘螨线粒体COI基因序列,在COI基因709 bp序列中共检测到16种单倍型,物种水平的单倍型多样性(h)为0.847、核苷酸多样性(Pi)为0.021 08,表明粉尘螨在物种水平上具有较高的遗传多样性;在种群水平上,安徽芜湖地区种群的遗传多样性最高,可能与其种群大小有关;AMOVA的结果表明群体间的遗传变异(87.34%)大于种群内的遗传变异(12.66%),种群间遗传分化显著(P粉尘螨种群可能经历了历史的扩张;单倍型网状进化分析无明显的谱系地理结构,可能与面粉贸易有关。粉尘螨不同地理种群的遗传多样性丰富,种群间遗传分化明显,人为干扰可能导致其不同地理种群交流频繁。

关键词：粉尘螨 COI基因种群遗传结构遗传多样性系统地理学

粉尘螨HSP60的基因克隆、表达及免疫学特性研究

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粉尘螨HSP60的基因克隆、表达及免疫学特性研究

作者：刘海娟广州医科大学

学位级别：硕士

目前，过敏性疾病已成为全球关注的公共卫生问题。尘螨广泛存在于人类居室环境的尘埃中，它作为一种重要的变应原在变态反应学研究中受到高度重视。尘螨可引起支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等多种变态反应性疾病，严重影响人类健... 详细信息

目前，过敏性疾病已成为全球关注的公共卫生问题。尘螨广泛存在于人类居室环境的尘埃中，它作为一种重要的变应原在变态反应学研究中受到高度重视。尘螨可引起支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等多种变态反应性疾病，严重影响人类健康。而尘螨中包含的引起变态反应的成分-尘螨变应原在研究中一直受到高度关注。并且，随着探索的深入,不断有新的尘螨变应原被识别和发现，这极大地加深了人类对尘螨变应原的认识，推动了尘螨过敏性疾病诊断、预防和治疗的进步。通常寄生虫的HSPs作为一种蛋白质有较好的免疫原性，一方面，有诱导宿主产生变态反应，成为粉尘螨变应原的潜在可能;另一方面，有作为抗原用于尘螨过敏性疾病特异性免疫预防和治疗的潜力。因此，本课题组在既往研究的基础上，选择粉尘螨热休克蛋白60（Heat shock protein60，Hsp60）为研究对象，以期探索和发现粉尘螨新的变应原组分，并对其免疫学特性进行初步研究。研究目的：以粉尘螨Hsp60为研究对象，测定和分析它的cDNA序列，克隆表达出高纯度的Hsp60蛋白片段，用重组蛋白与尘螨过敏病人血清反应，对该蛋白是否可能是变应原进行初步评估。研究方法： 1、粉尘螨总RNA的提取用Trizol提取总RNA。 2、粉尘螨cDNA的合成及PCR扩增以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA，根据与尘螨相近物种Hsp60蛋白的特征性和保守序列设计简并性引物，以cDNA为模板PCR扩增Hsp60基因片段。 3、测序及氨基酸序列分析将扩增获得的PCR产物进行测序，将测序后碱基序列编码的氨基酸序列进行同源性分析，并对氨基酸序列进行亲水性区域分析。 4、粉尘螨Hsp60基因片段的扩增和TA克隆根据测序结果设计特异性引物，并加入酶切位点，PCR扩增Hsp60基因片段，然后连接到PMD18-T载体上，并将阳性重组质粒送公司测序。 5、粉尘螨Hsp60基因片段亚克隆将TA克隆质粒和pET-32a（+）质粒分别双酶切，然后将目的基因片段连接在pET-32a（+）上，构建pET-32a（+）-Hsp60原核表达载体。 6、重组蛋白的表达与纯化将阳性重组质粒转化入大肠杆菌表达系统进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳观察表达情况，并进行可溶性分析。将表达的重组蛋白经Ni-NTA层析柱纯化。 7、重组蛋白Western blot鉴定以尘螨过敏病人血清为一抗与纯化的重组蛋白反应，以羊抗人IgE-HRP为二抗，最后用ECL化学发光法显示Western blot结果。 8、重组蛋白质谱分析将纯化的重组蛋白SDS-PAGE电泳条带切下后送公司做蛋白质谱检测。研究结果： 1、提取粉尘螨的RNA，逆转录合成cDNA，用简并引物成功扩增出约520bp大小的PCR产物。测序结果显示其碱基序列与Achromobacter Xylosoxidans Hsp60相似度为86%，其碱基编码的氨基酸与Advenella Mimigardefordensis Hsp60相似度可达92%。 2、成功的构建了原核表达载体pET-32a（+）-Hsp60，并表达出大小为37KD左右的重组蛋白，经Ni-NTA层析柱纯化后获得纯度较高的可溶性目的蛋白。 3、纯化的重组蛋白经Western blot鉴定，能与尘螨过敏病人血清中的IgE反应。 4、质谱分析结果显示：重组蛋白为Hsp60。结论： 1、结合免疫印迹、蛋白组学分析技术对尘螨新变应原进行分析和筛选是一种有效的方法，为新的尘螨变应原的发现提供了一种新的技术线路。 2、本研究通过简并引物PCR和基因测序方法首次确定了粉尘螨Hsp60部分cDNA序列。 3、通过基因克隆和大肠杆菌原核表达技术成功表达出粉尘螨Hsp60（片段）重组蛋白。且它能与粉尘螨过敏患者血清的IgE发生特异性结合，从而获得了Hsp60可作为粉尘螨变应原的重要证据。

关键词：粉尘螨 Hsp60 分析