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水稻类整合素蛋白的免疫定位及其编码基因的克隆与表达

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水稻类整合素蛋白的免疫定位及其编码基因的克隆与表达

作者：张昌轮扬州大学

学位级别：硕士

整合素是动物细胞粘附分子的重要成员,属于一类跨膜蛋白的超家族,是由两个跨膜糖蛋白亚基(α和β亚基)通过非共价键连接而成的异二聚体,介导细胞间的粘附作用和细胞内外的信号转导,是胞外基质-质膜-细胞骨架连续体的重要组成部分。植物... 详细信息

整合素是动物细胞粘附分子的重要成员,属于一类跨膜蛋白的超家族,是由两个跨膜糖蛋白亚基(α和β亚基)通过非共价键连接而成的异二聚体,介导细胞间的粘附作用和细胞内外的信号转导,是胞外基质-质膜-细胞骨架连续体的重要组成部分。植物中存在的与动物整合素具有类似结构与功能的蛋白被称为类整合素。水稻Os03g0199100是与拟南芥中编码类整合素基因(AT14A)具有同源序列的基因,并且预测蛋白结构表明其与动物整合素亚基的构成更加类似,推测Os03g0199100编码蛋白很可能即为水稻中的类整合素(OsILP)。本实验以水稻(日本晴)为材料,综合利用分子生物学,植物生理学,生物化学和细胞生物学等技术,以判明水稻中是否存在与动物整合素具有类似结构与功能的蛋白(类整合素),并克隆OsILP基因获得相应的转基因悬浮细胞系后初步研究其功能。主要结果如下:1.通过改善培养基和培养技术建立了野生型水稻(日本晴)悬浮细胞系。实验结果表明,液体培养基中pH值和生长素(2,4-D)含量对悬浮细胞系的建立和健壮生长影响较大。本实验条件下,当pH值为5.3和2,4-D浓度为2.0mg/L时悬浮细胞系长得尤为良好。2.以人整合素β1亚基抗体作探针,采用间接免疫荧光定位的方法,分别在水稻根尖细胞、愈伤细胞和悬浮细胞的细胞膜和细胞核上出现了类整合素蛋白标记的特异性荧光,提示其很可能也定位于细胞膜。3.采用RT-PCR和TOPO克隆的方法从水稻中克隆出了Os03g0199100基因,并与报告基因GFP融合构建了过表达载体,再通过原生质体瞬时表达技术研究了OsILP蛋白在细胞中的表达和定位,结果表明OsILP-GFP融合蛋白主要在质膜中表达。再通过农杆菌介导的方法侵染水稻悬浮细胞,获得过表达的转基因悬浮细胞系,结果进一步确证了OsILP蛋白主要定位于细胞膜。同时,转OsILP基因悬浮细胞系的建立也为该蛋白生理功能的研究创造了条件。以上结果表明,水稻细胞质膜上存在与动物整合素具有类似结构(或抗原决定簇)的蛋白——类整合素。其是否与整合素一样作为质膜上的中间分子介导了植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体,从而参与了细胞内外信号的转导还有待进一步深入研究。

关键词：膜蛋白类整合素蛋白悬浮细胞基因克隆与转化水稻

植物细胞壁—类整合素—细胞骨架连续体在植物响应渗透胁迫信号过程中的作用

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植物细胞壁—类整合素—细胞骨架连续体在植物响应渗透胁迫信号过...

作者：陈枫扬州大学

学位级别：硕士

阐明植物对逆境的响应机制,提高植物的抗逆性,已成为当前植物科学研究的热点。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)悬浮细胞和玉米(Zea maize L.)幼苗为试验材料,综合利用生物化学和细胞生物学等技术,探讨了类整合素蛋白、细胞骨架及... 详细信息

阐明植物对逆境的响应机制,提高植物的抗逆性,已成为当前植物科学研究的热点。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)悬浮细胞和玉米(Zea maize L.)幼苗为试验材料,综合利用生物化学和细胞生物学等技术,探讨了类整合素蛋白、细胞骨架及两者的相互作用在渗透胁迫诱导细胞合成ABA中的作用,为进一步深入研究植物细胞壁.细胞膜-细胞骨架连续体在渗透胁迫信号传导过程中的作用提供一些理论依据。结果表明: 1、用动物整合素β1亚基抗体作探针,结合蛋白免疫印迹和荧光定位的方法,在拟南芥悬浮细胞的细胞膜和玉米幼苗的根尖细胞的细胞膜与核中均检测到类整合素蛋白的存在,分子量分别在110KD和80KD。 2、通过显微观察发现,正常细胞的质膜与细胞壁是粘连在一起的,没有明显的分界线,在渗透浓度为722mmol/kg的改良培养基中培养6hr的细胞发生了局部的质壁分离,而经RGD预处理后再进行胁迫培养的细胞则发生了完全的质壁分离,说明类整合素蛋白介导了细胞壁与细胞膜之间的粘连作用。 3、比较研究了拟南芥悬浮培养细胞及原生质体在渗透胁迫过程中内源ABA含量的变化。结果表明,与未受渗透胁迫的细胞或原生质体相比,具有细胞壁的正常细胞在渗透胁迫处理后,ABA浓度升高了2.3倍,而原生质体经胁迫处理后ABA浓度只升高了1.7倍,这说明细胞壁和/或细胞壁与细胞膜之间的相互作用在拟南芥悬浮细胞响应渗透胁迫和渗透胁迫诱导细胞合成ABA过程中起着重要作用。对正常细胞、胁迫处理细胞及RGD预处理后再胁迫培养的细胞的内源ABA含量变化进行了比较,发现经RGD预处理后再胁迫培养的细胞内源ABA含量较之正常培养的细胞有所提高,但与胁迫处理的细胞相比则有所下降,因而推测类整合素蛋白在质膜-细胞壁连续体系感受水分亏缺信号过程中起关键性作用。 4、以15%PEG对玉米幼苗分别处理0、12hr、24hr、48hr,通过荧光定位的方法观察到,细胞在遭受干旱胁迫时,其体内形成更多的周质微管以适应外界环

关键词： ABA 拟南芥细胞壁-细胞膜-细胞骨架连续体类整合素蛋白微管骨架渗透胁迫玉米

拟南芥AT14A蛋白在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

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拟南芥AT14A蛋白在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

作者：王洪成扬州大学

学位级别：硕士

动物细胞中存在着细胞外基质-粘附分子(整合素等)-细胞骨架连续体,该连续体在细胞内外信号的传递和转换中发挥着极其重要的作用。而植物细胞胞外基质则是由纤维素、半纤维素和果胶等成分组成的细胞壁。近年来的研究认为,植物中也存在一... 详细信息

动物细胞中存在着细胞外基质-粘附分子(整合素等)-细胞骨架连续体,该连续体在细胞内外信号的传递和转换中发挥着极其重要的作用。而植物细胞胞外基质则是由纤维素、半纤维素和果胶等成分组成的细胞壁。近年来的研究认为,植物中也存在一个细胞壁-质膜-细胞骨架连续体,并能感受外界的变化并做出相应的反应。AT14A是拟南芥中一个与整合素蛋白具有部分同源序列的未知功能蛋白,目前对于AT14A蛋白是否为拟南芥中的类似动物整合素的蛋白(类整合素)还缺乏直接的证据。本文主要就AT14A蛋白在介导拟南芥细胞间的相互粘附及在介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中的作用入手来研究其功能。主要结果如下:1、采用农杆菌介导的转基因方法,将AT14A-GFP融合基因转至拟南芥野生型和AT14A突变体悬浮细胞中。从而构建拟南芥AT14A过表达和at14a-AT14A基因型悬浮细胞,为进一步研究AT14A的功能提供实验材料。GFP抗体的western blotting结果,证明在拟南芥AT14A过表达和at14a-AT14A基因型悬浮细胞中均存在融合蛋白的表达。2、细胞形态观察结果表明,突变体细胞与at14a-AT14A基因型细胞类似,与野生型和过表达基因型细胞形态相比,细胞形态变小、变圆。利用荧光定位技术,结合荧光显微镜的观察发现,缺失型突变体at14a悬浮细胞的微丝束变粗,且排列变得稀疏,而过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞的微丝排列较野生型密集;缺失型突变体at14a悬浮细胞的微管排列杂乱而无规则,但过表达转AT14A-GFP融合基因细胞的微管形态及排列与野生型无明显区别。但是,at14a-AT14A基因型的细胞骨架形态与突变体类似。说明AT14A蛋白与细胞骨架系统关系密切,影响了细胞形态。3、通过对类整合素蛋白参与细胞壁与细胞膜之间的粘连作用进行药理学研究发现,在用类整合素相关物质RGD处理后,各基因型细胞均发生一定的质壁分离现象,但突变体变化不及其它三种基因型明显。在用渗透胁迫处理后,突变体基因型细胞质壁分离明显,而at14a-AT14A基因型质壁分离情况与野生型和过表达基因型类似。在用类整合素相关物质RGD处理后,再进行渗透胁迫处理,则突变体基因型的质壁分离情况与仅用胁迫处理时的质壁分离情况类似,而其它三种基因型较之则发生了显著的质壁分离。说明AT14A蛋白有利于细胞壁和细胞质膜间的联结。4、对四种基因型细胞的粘附程度进行分析发现,突变体的细胞聚集程度明显低于野生型和过表达基因型,而在转AT14A-GFP后,at14a-AT14A基因型细胞的聚集程度明显增强,达到了野生型水平。说明AT14A蛋白在细胞粘附方面发挥了直接作用。5、采用类整合素和细胞骨架相关物质对细胞进行处理后,观察细胞骨架系统。结果表明,用微管或微丝解聚剂处理后,突变体基因型的细胞骨架系统的解聚较野生型与过表达更加明显;而at14a-AT14A基因型在微管或微丝解聚剂处理后,解聚现象较突变体基因型细胞有一定程度的弱化。6、通过分裂泛素化酵母双杂交发现,AT14A与肌动蛋白没有直接的相互作用,因此推测AT14A对细胞骨架形态的影响可能通过间接地方式进行,例如通过与肌动蛋白结合蛋白相互作用,来进一步影响细胞骨架的形态。总之,AT14A蛋白在介导拟南芥细胞与细胞之间的相互联系和介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中发挥重要作用。

关键词：拟南芥 AT14A蛋白细胞壁-质膜-细胞骨架连续体类整合素蛋白细胞骨架分裂泛素化酵母双杂交

拟南芥AT14A蛋白的细胞学定位及在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

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拟南芥AT14A蛋白的细胞学定位及在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连...

作者：汪娟扬州大学

学位级别：硕士

植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的研究目前还处于起步阶段,特别是质膜上的联结分子特性与功能还未形成定论。在动物细胞质膜上存在一类整合素蛋白(integrin),它是一类胞外基质受体,介导细胞间的粘附作用和细胞内外的信号转导,并且参与... 详细信息

植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的研究目前还处于起步阶段,特别是质膜上的联结分子特性与功能还未形成定论。在动物细胞质膜上存在一类整合素蛋白(integrin),它是一类胞外基质受体,介导细胞间的粘附作用和细胞内外的信号转导,并且参与调节多种细胞功能,如细胞分化、细胞与细胞间的相互作用、细胞对外界环境应答等。在植物细胞中是否也存在类似于动物细胞中的整合素蛋白分子目前尚无直接的实验证据。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段与动物整合素蛋白同源,然而,目前还不清楚该蛋白是否就是植物细胞中的整合素蛋白(称为类整合素, integrin-like proteins)?如是,其功能又是如何?针对上述科学问题,本研究首先从拟南芥基因组中克隆了编码AT14A的基因序列,构建了相应突变体和过表达转基因悬浮培养细胞系,最后研究了该蛋白在介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中的功能。取得的主要结果如下:1、采用RT-PCR和TOPO克隆的方法从拟南芥中克隆出了AT14A,并与含GFP报告基因的表达载体连接,得到AT14A-GFP融合基因,通过农杆菌介导的方法转化野生型植株及悬浮细胞,获得了相应的转基因植株和悬浮细胞体系。通过观察GFP的荧光,确定AT14A在组织和细胞水平的定位。同时,完整植物材料体系的建立为研究AT14A的功能奠定了基础。2、利用蛋白质免疫印迹技术,以GFP抗体作为探针,在过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞总蛋白与膜蛋白中均检测到了AT14A-GFP融合蛋白的存在,其分子量在70 kDa左右。且通过免疫印迹方法,在膜蛋白中也检测到了AT14A-GFP融合蛋白的存在,证实AT14A定位在质膜上。3、通过光学显微镜观察细胞的形态,发现缺失型突变体at14a悬浮细胞的形态发生明显变化,即60%以上变成球形。利用荧光定位技术,结合激光共聚焦显微镜的观察,发现野生型、缺失型突变体at14a、过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的细胞骨架的结构与排列存在差异:缺失型突变体at14a悬浮细胞的微丝束变粗,且排列变得稀疏,而过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞的微丝排列较野生型密集;缺失型突变体at14a细胞的微管排列杂乱而无规则,但过表达转AT14A-GFP融合基因细胞的微管形态与排列与野生型无明显区别。4、对悬浮细胞的细胞团大小的观察及统计的结果表明,野生型悬浮细胞57%的细胞团包含2-10个细胞,40%的细胞团包含10个以上细胞;缺失型突变体at14a悬浮细胞42%以单个游离的形式存在,且低于10%的细胞团包含10个以上细胞;而过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的细胞团有74%包含10个以上细胞。此结果说明,AT14A参与了细胞与细胞之间的粘附。对三种基因型的悬浮细胞进行渗透胁迫处理的结果表明野生型细胞有90%以上发生部分质壁分离,约6%发生完全分离;而缺失型突变体at14a细胞均发生了质壁分离,并且其中62%发生了完全质壁分离;过表达转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的分离情况与野生型无明显差异。通过测定三种基因型植株离体叶片失水速率的测定结果表明缺失型突变体at14a离体叶片的失水速率最大,野生型次之,过表达植株的离体叶片的失水速率最小。以上结果提示:AT14A作为细胞壁(CW)-质膜(PM)-细胞骨架(CTK)连续体的重要联结分子,由于AT14A的缺失,导致细胞壁与质膜的粘附性降低,所以,在同样的胁迫条件下,缺失型突变体at14a悬浮细胞完全质壁分离的情况最为明显。并且,AT14A参与了细胞对渗透胁迫的响应过程,缺失型突变体由于AT14A功能的缺失,因而失去了对于渗透胁迫的响应能力。综合以上结果表明,AT14A是拟南芥细胞壁—质膜—细胞骨架连续体的中间成员,并与细胞骨架、细胞形态的改变之间存在密切关系,它还介导了细胞间的粘附作用,参与了拟南芥响应渗透胁迫的信号转导过程。

关键词： AT14A 拟南芥细胞壁-质膜-细胞骨架连续体类整合素蛋白渗透胁迫

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过表达转OsILP基因水稻株系的构建

江苏农业科学 2014年第10期42卷 17-20页

作者：孙伟清张昌轮袁茜梁建生吕冰扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

采用RT-PCR和TA克隆技术,从水稻品种日本晴中扩增出类整合素候选基因(integrin-like protein,ILP)OsILP的cDNA片段。经测序鉴定,克隆获得的目的片段长为1 167 bp,包含完整的CDS,编码388个氨基酸,预测分子量43 ku。进而将该片段连接至表... 详细信息

采用RT-PCR和TA克隆技术,从水稻品种日本晴中扩增出类整合素候选基因(integrin-like protein,ILP)OsILP的cDNA片段。经测序鉴定,克隆获得的目的片段长为1 167 bp,包含完整的CDS,编码388个氨基酸,预测分子量43 ku。进而将该片段连接至表达载体pTCK303中,通过PCR鉴定与酶切验证,结果表明成功构建了pTCK303-OsILP过表达载体。并将表达载体质粒转化为农杆菌EHA105,再通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,获得了过表达转OsILP基因水稻株系。

关键词：水稻类整合素蛋白过表达转基因株系