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拟南芥类受体胞质激酶RBK2的生物信息学分析

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生物技术 2016年第3期26卷 280-286页

作者：易黎曹刚强位芳李瑞梁秋霞郑州大学生命科学学院河南郑州450001 郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室河南郑州450052

[目的]对拟南芥类受体胞质激酶RBK2(ROP binding protein kinases 2)的结构、分子进化和基因表达等进行预测分析。[方法]利用生物信息学在线相关数据库和分析软件对目的蛋白的基本理化性质、二级及三级结构、同源性、基因表达、蛋白定... 详细信息

[目的]对拟南芥类受体胞质激酶RBK2(ROP binding protein kinases 2)的结构、分子进化和基因表达等进行预测分析。[方法]利用生物信息学在线相关数据库和分析软件对目的蛋白的基本理化性质、二级及三级结构、同源性、基因表达、蛋白定位、相互作用蛋白进行分析预测。[结果]拟南芥类受体胞质激酶RBK2是一个亲水性不稳定蛋白,主要构成原件为α螺旋及β片状折叠,进化树构建及多序列比对显示其与琴叶拟南芥中名为激酶家族蛋白的蛋白进化距离最近。主要存在于细胞质和细胞核中,其编码基因在成熟花粉中强烈表达,且RBK2与PP2C家族蛋白有较强的相互作用。[结论]拟南芥RBK2很可能通过参与信号转导途径在植物种子萌发、花粉成熟及细胞分裂等方面发挥重要作用。

关键词：拟南芥类受体胞质激酶 RBK2 生物信息学

水稻类受体胞质激酶STRK1参与脱落酸信号响应的研究

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水稻类受体胞质激酶STRK1参与脱落酸信号响应的研究

作者：黄剑湖南大学

学位级别：硕士

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)参与了植物生长发育的多种过程并发挥了极其重要的作用,包括种子成熟、种子休眠、气孔关闭和幼苗生长等,在植物应对非生物胁迫如寒冷、干旱和盐的响应机制中,ABA也发挥着重要作用。类受体胞质激酶介... 详细信息

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)参与了植物生长发育的多种过程并发挥了极其重要的作用,包括种子成熟、种子休眠、气孔关闭和幼苗生长等,在植物应对非生物胁迫如寒冷、干旱和盐的响应机制中,ABA也发挥着重要作用。类受体胞质激酶介导的信号转导是植物响应不同环境胁迫和生长发育的重要调节机制。本实验室前期研究从水稻(Oryza sativa L.)中鉴定了一个类受体胞质激酶STRK1,它通过磷酸化Cat C的Tyr210而激活其活性,调节HO稳态来提高盐和氧化胁迫耐受性。ABA作为调控盐胁迫响应的重要激素,其信号转导机制已研究得比较清楚,然而参与其信号通路的类受体胞质激酶却鲜有报道。本研究初步探究了STRK1参与ABA信号转导以调控水稻盐胁迫响应的分子机制,主要结果如下:(1)STRK1参与了ABA信号响应。表达谱分析发现,STRK1的表达受ABA的诱导。ABA敏感性分析发现,相较于野生型,strk1敲除植株对ABA不敏感,而STRK1过表达植株对ABA更敏感,说明STRK1能够增强水稻幼苗对ABA的敏感性。对ABA合成相关基因的表达量检测发现,STRK1影响了部分ABA合成相关基因的表达;对抗氧化防护相关的基因和ABA依赖的胁迫响应基因的表达量检测发现,过表达STRK1可以上调OsCat B、OsSod Cc2和ABA依赖胁迫基因的表达,而敲除STRK1则下调相关基因的表达。这些研究结果说明,STRK1可能通过影响ABA依赖的胁迫响应而参与ABA的信号转导。(2)STRK1与OsABIL2在细胞膜相互作用。通过查找拟南芥磷酸化蛋白质组学的网站数据发现,ABA信号通路中PP2Cs A亚族成员At ABI1存在酪氨酸位点的磷酸化。蛋白质同源序列比对发现,水稻OsABIL2与At ABI1同源性最高。于是从水稻中克隆了OsABIL2基因,并通过酵母双杂交、Bi FC和GST-Pull down实验进一步验证了STRK1与OsABIL2在体内外能相互作用,且在细胞膜上互作。(3)STRK1可能通过与OsABIL2互作来参与ABA信号响应。利用生物信息学网站分析OsABIL2基因结构和时空表达模式发现,OsABIL2含有4个外显子和3个内含子,在营养期和叶片中表达量最高。亚细胞定位结果显示,OsABIL2定位于细胞膜,与STRK1的亚细胞定位和OsABIL2-STRK1互作位置一致。随后,构建了OsABIL2过表达和敲除载体,利用农杆菌转化并鉴定得到了3个OsABIL2过表达株系和1个纯合敲除株系osabil2及若干杂合子株系,相关表型和生理性状还有待分析。综上所述,本论文初步证明STRK1参与了ABA信号响应,推测STRK1可能通过在细胞膜上与OsABIL2互作而参与ABA信号转导的调控。另外,构建了STRK1和OsABIL2相关的水稻遗传材料,为进一步解析STRK1参与ABA信号转导调控奠定了基础。

关键词：脱落酸类受体胞质激酶 STRK1 水稻(Oryza sativa L.)

水稻类受体胞质激酶LRRK1与互作蛋白GF14f的磷酸化分析

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水稻类受体胞质激酶LRRK1与互作蛋白GF14f的磷酸化分析

作者：何勇湖南大学

学位级别：硕士

水稻作为固着植物需要面对不断变化的外部环境,其中就有危害植物生长发育的不良环境。为了应对这些危害,植物进化出了不同的防御机制,其中蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰发挥了关键的作用。水稻类受体胞质激酶LRRK1是一类不具有胞外结构域... 详细信息

水稻作为固着植物需要面对不断变化的外部环境,其中就有危害植物生长发育的不良环境。为了应对这些危害,植物进化出了不同的防御机制,其中蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰发挥了关键的作用。水稻类受体胞质激酶LRRK1是一类不具有胞外结构域的类受体激酶,实验室前期通过质谱手段分析从水稻体内IP下来的LRRK1复合体鉴定到了一个水稻14-3-3蛋白GF14f。在植物中,14-3-3蛋白作为一个桥梁蛋白,广泛地参与了植物生理生化过程。因此,为揭示LRRK1与GF14f的具体分子机制,本研究将通过分子与生物化学实验分析了2个蛋白的互作情况,并鉴定其磷酸化位点。具体研究结果如下:(1)通过生物信息学分析发现,OsGF14f在水稻所有组织中都有表达。对蛋白磷酸化位点预测发现,OsGF14f含有丰富的磷酸化位点,并推测LRRK1与GF14f可能存在相互作用,且GF14f是LRRK1磷酸化的底物蛋白。(2)亚细胞定位实验结果显示,GF14f定位于细胞质中。酵母双杂交、GST pull-down和BiFC等3个独立实验证明,LRRK1和GF14f存在直接相互作用,且其互作场所位于细胞膜上。(3)原核表达和纯化LRRK1和GF14f,并于体外磷酸化反应体系中孵育,然后磷酸化抗体的Western blot分析发现,添加了ATP的实验组相对于不添加ATP的对照组,GF14f的丝氨酸磷酸化信号显著增强,说明LRRK1可以磷酸化GF14f。(4)对体外磷酸化的GF14f进行质谱分析,共鉴定到9个磷酸化位点,其中3个苏氨酸位点:T224、T235和T238,6个丝氨酸位点:S78、S100、S112、S143、S160和S239。(5)将GF14f的相关磷酸化位点突变为丙氨酸以模拟去磷酸化,再于体外与LRRK1孵育并用磷酸化抗体检测发现,当GF14f的S78突变为丙氨酸后,其磷酸化信号显著下降,说明S78为LRRK1磷酸化GF14f的主要磷酸化位点。我们推测,LRRK1可能是通过磷酸化GF14f的S78位点来完成相关信号的级联转导。综上所述,本研究证明了水稻类受体胞质激酶LRRK1可以与水稻14-3-3蛋白家族中的GF14f相互作用,并初步发现LRRK1主要磷酸化GF14f的S78,推测LRRK1可能通过磷酸化GF14f的S78位点来完成磷酸化信号的传递。该研究结果为后续解析水稻LRRK1和14-3-3蛋白参与的信号转导机制提供了一定的前期基础。

关键词：磷酸化修饰类受体胞质激酶 LRRK1 GF14f 磷酸化位点

拟南芥类受体胞质激酶R118在耐铝机制中的功能初探

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拟南芥类受体胞质激酶R118在耐铝机制中的功能初探

作者：马哲宇浙江大学

学位级别：硕士

铝毒害是酸性土壤上限制作物生产的主要因素之一。尽管以STOP1为核心转录因子的铝信号转导机制已研究得越来越深入,但植物如何感受铝离子并将信号传递给STOP1仍不清楚。类受体激酶（Receptor-like kinase,RLK）是一类定位于细胞膜,承担... 详细信息

铝毒害是酸性土壤上限制作物生产的主要因素之一。尽管以STOP1为核心转录因子的铝信号转导机制已研究得越来越深入,但植物如何感受铝离子并将信号传递给STOP1仍不清楚。类受体激酶（Receptor-like kinase,RLK）是一类定位于细胞膜,承担胞外信号感知和转导的膜蛋白,其可能在信号转导的上游发挥功能。但RLK通常功能冗余,为此我们实验室前期构建了一系列RLK过表达材料。通过铝敏感性筛选,我们鉴定到了一个对铝表现超敏感的过表株系OE118,并且发现RLK118（R118）属于类受体胞质激酶（Receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK）亚家族。通过不同处理体系进行表型验证后,我们发现OE118表现出对铝专一性的敏感表型,意味着R118可能负调控拟南芥耐铝性。同时,我们发现r118功能缺失突变体的铝敏感性与野生型无明显差异,说明R118可能与其它同源RLK存在功能冗余。进一步的生理实验结果显示,OE118根尖铝含量明显高于野生型,而根系苹果酸分泌量则显著低于野生型,说明R118过表达可能通过影响根系有机酸分泌进而调控拟南芥耐铝性。定量PCR结果显示,在铝处理条件下,OE118根中的ALMT1和MATE表达水平有所下调,说明R118过表达会抑制耐铝相关基因的表达水平。通过双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）,我们验证了R118与STOP1存在互作,并在随后的转录激活实验中,我们发现R118会显著抑制STOP1对ALMT1的转录激活能力。以上结果初步说明,R118可能通过与STOP1互作,抑制STOP1对下游基因的转录激活,从而下调ALMT1和MATE的表达水平,降低根系有机酸的分泌量,最终负调控拟南芥的耐铝性。因此,本研究可能发现了一个新的调控铝信号转导的上游重要基因。

关键词：铝毒害类受体胞质激酶有机酸分泌 STOP1 拟南芥

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植物类受体胞质激酶的结构和功能

植物生理学通讯 2010年第10期46卷 1001-1006页

作者：于凯李玉花蓝兴国东北林业大学生命科学学院发育生物学研究室哈尔滨150040

本文介绍植物类受体胞质激酶的结构及其在植物的抗病、抗逆、生长发育、自交不亲和、油菜素内酯信号转导等方面的功能。

关键词：类受体胞质激酶抗病性抗逆性自交不亲和油菜素内酯信号转导

水稻纹枯菌诱导受体激酶RLCK6功能初步探究及内参基因的筛选

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水稻纹枯菌诱导受体激酶RLCK6功能初步探究及内参基因的筛选

作者：赵文娟四川农业大学

学位级别：硕士

水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻三大病害之一,其严重制约着水稻生产,近年来,主要采取的防护措施为农药和化学试剂的喷施以及选育抗病品种,其中化学试剂和农药的大量使用,不仅造成食物中农药残留、加重农民负担,还对环境造成很大... 详细信息

水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻三大病害之一,其严重制约着水稻生产,近年来,主要采取的防护措施为农药和化学试剂的喷施以及选育抗病品种,其中化学试剂和农药的大量使用,不仅造成食物中农药残留、加重农民负担,还对环境造成很大威胁。因此选育抗性品种是降低水稻纹枯病的最佳手段。为了向育种工作提供大量的抗性基因资源以及能够在未来培育出抗病性材料。本课题组前期对纹枯病中抗水稻品种特青和高感水稻品种Lemont进行纹枯病诱导,不同时间点取样转录组测序。本试验以此为基础,同时结合近年来受体激酶类基因在抗性方面的相关报道,在转录组数据中对受体激酶类基因展开分析,获得后侯选基因RLCK6,进行功能分析,主要得出以下结果:***6表达模式:通过纹枯菌诱导抗感品种不同时间点定量分析,发现RLCK6主要在诱导前期上调表达,同时对不同组织不同时期定量分析,结果显示,RLCK6主要在分蘖期水稻叶和叶鞘中特异性表达;***6抗性验证:我们将构建成功的敲除突变体离体、活体接菌,分析发现突变体对纹枯病的抗性降低,对敲出突变体接菌后测定叶绿素含量,其叶绿素含量降低,对相关病程蛋白(防御基因)进行定量分析,其表达量显著降低,以上结果说明候选基因RLCK6参与了纹枯病抗性过程;3.外源诱导物处理后RLCK6的表达分析:我们对野生型中抗品种特青和感病品种Lemont外施几丁质,不同时间点取样定量分析,其中,在中抗品种特青中RLCK6上调表达,在Lemont中处理前后没有显著差异,又对对几丁质激发子识别复合物相关基因在敲除突变体中定量检测,发现其表达量降低,由此初步推测RLCK6可能是被真菌分泌的PAMP分子几丁质识别触发PTI免疫反应,使其产生抗病性;同时我们以同样的方法对其外施SA,定量分析结果显示,在中抗品种特青中RLCK6的表达量升高,在高感品种Lemont中几乎不表达,此结果初步推测RLCK6可能参与SA抗性途径。4.内参基因筛选:特青中立枯丝核菌侵染水稻叶片不同时间点表达最稳定的基因为ACT,而Lemont中立枯丝核菌侵染水稻叶片不同时间点表达最稳定的基因为UBC和UBQ5。

关键词：水稻纹枯病类受体胞质激酶几丁质

植物RLCK的生物学功能与信号途径研究进展

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植物生理学报 2014年第7期50卷 885-890页

作者：何含杰张党权唐丽杨丹中南林业科技大学经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室长沙410004 中南林业科技大学林业生物技术湖南省重点实验室长沙410004 中南林业科技大学湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心长沙410004 湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室长沙410125

类受体胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)是一类无胞外信号肽结构域和跨膜结构域的激酶家族。在植物中,RLCK通过磷酸化下游靶蛋白而发挥功能,主要参与了植物的生长、信号转导、非生物胁迫和生物胁迫应答等生理过程。本... 详细信息

类受体胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)是一类无胞外信号肽结构域和跨膜结构域的激酶家族。在植物中,RLCK通过磷酸化下游靶蛋白而发挥功能,主要参与了植物的生长、信号转导、非生物胁迫和生物胁迫应答等生理过程。本文着重介绍拟南芥和水稻中RLCK的分类、生物学功能及其参与的信号途径。

关键词：类受体胞质激酶生理过程信号途径拟南芥水稻

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海岛棉GbRLCK10基因克隆及表达分析

西北植物学报 2017年第11期37卷 2130-2138页

作者：赵曾强孙国清张国丽马盼盼王志军叶春秀谢宗铭新疆农垦科学院生物技术研究所/作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室新疆石河子832000 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

该研究以拟南芥抗逆基因At1g67520为探针,利用海岛棉ESTs数据库,通过电子克隆获得海岛棉RLCK家族基因GbRLCK10,解析该基因组结构,并结合qRT-PCR技术分析该基因mRNA的组织表达特征以及在不同胁迫诱导下的表达模式,为揭示RLCK家族基因在... 详细信息

该研究以拟南芥抗逆基因At1g67520为探针,利用海岛棉ESTs数据库,通过电子克隆获得海岛棉RLCK家族基因GbRLCK10,解析该基因组结构,并结合qRT-PCR技术分析该基因mRNA的组织表达特征以及在不同胁迫诱导下的表达模式,为揭示RLCK家族基因在海岛棉中的表达调控及作用机制提供理论依据。结果显示:(1)获得海岛棉类受体胞质激酶(RLCK)基因,其开放阅读框(ORF)为1 179bp,编码392个氨基酸,具有典型的Serine/Threonine结构域,属于RLCK家族,与GaRLCK10(XP_017604046.1)亲缘关系较近,命名为GbRLCK10(登录号2022184),且该基因由5个外显子和4个内含子组成。(2)实时荧光定量(qRT-PCR)检测显示,GbRLCK10基因在抗病品种‘新海21’和感病品种‘新海14’的根、茎、叶中均有表达;当黄萎病菌诱导后,GbRLCK10基因在抗病品种中对于病原菌的响应时间早于感病品种,且对黄萎病菌响应更强烈,推测该基因参与棉花对黄萎病的响应;盐(NaCl)、干旱(PEG-6000)处理‘新海21’后,GbRLCK10基因在NaCl处理下响应时间要早于PEG-6000处理,但对PEG-6000处理响应更强烈;分别用4种激素处理‘新海21’后,GbRLCK10均能被诱导表达,且在水杨酸(SA)处理后表现为先增加后下降再增加趋势,在乙烯(ET)处理后表达量为持续上升趋势,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理后呈先升高然后下降的趋势,但GbRLCK10基因对赤霉素(GA3)响应不明显。研究表明,GbRLCK10基因具有RLCK基因家族典型特征,该基因随黄萎病菌、NaCl、干旱、激素处理时间推移而发生变化,推测GbRLCK10基因可能参与了棉花对黄萎病菌、NaCl、干旱、激素胁迫的应答反应,但其功能仍需进一步研究。

关键词：棉花类受体胞质激酶 GbRLCK10基因克隆表达分析

棉花GhPBL1基因克隆及抗枯萎病功能研究

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南方农业学报 2022年第12期53卷 3307-3317页

作者：赵曾强李艳军彭建智朱金成张薇石河子大学农学院新疆石河子832000 新疆农垦科学院棉花研究所新疆石河子832000

【目的】克隆棉花中类受体胞质激酶(RLCK)基因GhPBL1,并进行抗枯萎病功能研究,为棉花抗病分子育种提供新的基因资源。【方法】基于枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据,并结合棉花数据库,从中筛选并克隆棉花RLCK家族基因GhPBL1,利用生... 详细信息

【目的】克隆棉花中类受体胞质激酶(RLCK)基因GhPBL1,并进行抗枯萎病功能研究,为棉花抗病分子育种提供新的基因资源。【方法】基于枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据,并结合棉花数据库,从中筛选并克隆棉花RLCK家族基因GhPBL1,利用生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量技术(qRT-PCR)检测基因在不同抗性品种的不同组织及枯萎病菌和外源激素处理下的表达情况,并通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术研究GhPBL1基因的抗枯萎病功能。【结果】GhPBL1基因的开放阅读框(ORF)为1116 bp,编码371个氨基酸残基,含有STYKc保守结构域,位于第81~360位氨基酸,属于RLCK家族基因。GhPBL1基因在抗病材料和感病材料的根、茎和叶中均有表达,且均在根中的相对表达量最高。枯萎病菌处理后,抗病材料中GhPBL1基因的表达水平明显高于感病材料。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)均能诱导GhPBL1基因的表达,但该基因对SA胁迫响应时间早于MeJA胁迫。与对照植株(TRV∶00)相比,TRV∶GhPBL1沉默植株更易感病,且其抗病相关基因GhEDS1、GhCCR1、GhHCT1和Gh4CL的相对表达量显著(P<0.05)较低,但GhPR5基因的相对表达量极显著(P<0.01)较高。【结论】GhPBL1基因具有明显的组织表达特异性,在抗病材料和感病材料中的表达水平存在差异,能被枯萎病菌诱导表达上调,且能响应SA和MeJA胁迫,推测GhPBL1基因在棉花抗枯萎病和外源激素胁迫中发挥正调控作用。

关键词：棉花枯萎病菌类受体胞质激酶 GhPBL1 表达分析功能研究