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糖尿病治疗药物筛选模型的建立及金丝桃素对胰岛β细胞的保护作用

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糖尿病治疗药物筛选模型的建立及金丝桃素对胰岛β细胞的保护作用

作者：任书静东北师范大学

学位级别：硕士

目的在细胞水平,建立以细胞内游离钙离子浓度为检测指标的糖尿病治疗药物筛选模型。在组织水平,建立胰岛素双时相分泌的灌流模型。并以此为基础,探究金丝桃素对胰岛β细胞的潜在作用:对细胞内游离钙离子的作用;在正常培养条件与高糖、... 详细信息

目的在细胞水平,建立以细胞内游离钙离子浓度为检测指标的糖尿病治疗药物筛选模型。在组织水平,建立胰岛素双时相分泌的灌流模型。并以此为基础,探究金丝桃素对胰岛β细胞的潜在作用:对细胞内游离钙离子的作用;在正常培养条件与高糖、高脂损伤模型下,金丝桃素对胰岛β细胞的保护作用;以及金丝桃素对胰岛β细胞分泌功能的影响。方法1.建立β细胞游离钙检测模型:以INS-1细胞为对象,用fura2-AM荧光探针孵育细胞后,在BD-pathway 855高内涵仪器上进行高钾和高糖的实时刺激检测,获得细胞内游离钙离子实时变化曲线;2.建立胰岛灌流实验模型:用剪碎胶原酶消化法获得C57小鼠的胰岛。自制灌流机器,将胰岛装在灌流器的胰岛舱中,低糖(3mM)溶液预灌流30min后进行灌流实验:即低糖溶液灌流1Omin后高糖(33mM)溶液灌流20min,ELISA检测每分钟流出液中胰岛素含量,绘制小鼠胰岛灌流曲线;3.金丝桃素对胰岛β细胞的作用:(1)对胰岛β细胞钙内流的影响:用含20nM、200nM、2μM金丝桃素培养基分别孵育INS-1或RIN-m5f胰岛β细胞,24h后,利用高内涵仪器进行高钾实验,检测细胞内游离钙离子浓度变化;(2)对胰岛β细胞活力的影响:用含20nM、200nM、2μM金丝桃素培养基分别孵育INS-1或RIN-m5f细胞,24h后,MTT法检测细胞活力;(3)高糖毒性保护实验:INS-1或RIN-m5f细胞分别用正常培养基(11mM葡萄糖)、高糖(33mM葡萄糖)、含不同浓度金丝桃素的高糖培养基(金丝桃素浓度分别为20nM、200nM、2μM)培养,72h后,MTT法检测细胞活力;(4)高脂毒性保护实验:INS-1或RIN-m5f细胞分别用含OμM、100μM、200μM、300μM棕榈酸盐(PA)的培养基,同时用含20nM、200nM、2μM金丝桃素的不同浓度PA培养基(100μM、200μM、300μM)培养,72h后,MTT法检测细胞活力;(5)胰岛素分泌实验:分别用OnM、20nM、200nM、2μM的金丝桃素孵育INS-1细胞24h,之后弃去上清,低糖溶液孵育30min后,分别用低糖(3mM)、高钾(30mM)、高糖溶液(33mM)刺激INS-1细胞30min,之后收集上清,ELISA法检测胰岛素含量。结果1.β细胞游离钙浓度检测模型的建立:胰岛β细胞负载fura-2探针后,进行高钾实验,高内涵仪器记录下1.5min内细胞内游离钙离子浓度变化,结果表明:当给予高钾刺激后,380nm荧光强度下降,340nm荧光强度上升,380下降的幅度约为340上升幅度的四倍,340/380比率迅速上升,上升幅度在0.2左右;2.胰岛灌流实验模型的建立:剪碎胶原酶消化方法获得分散较好的较完整胰岛,双硫腙染色呈阳性反应。成功制作出胰岛灌流装置,负载胰岛后,获得胰岛素双时相分泌曲线:当给予高糖刺激后,在1-2min内胰岛素含量迅速上升,胰岛素峰值为基线的1.6倍,之后胰岛素含量迅速下降至1.4倍,并基本维持在该水平;3.金丝桃素抑制胰岛β细胞钙离子内流:20nM、200nM、2μM的金丝桃素在5-10min瞬时作用时间内对细胞内游离钙离子浓度均没有影响。用20nM、200nM、2μM的金丝桃素分别对INS-1细胞进行24h的长时间孵育后进行高钾测试,结果表明:与对照组相比,200nM、2μM金丝桃素显著抑制细胞内钙升高;进一步实验证明金丝桃素对INS-1细胞内钙浓度的抑制作用具有浓度依赖性。利用RIN-m5f细胞重复上述实验,结果表明:20nM、200nM、2μM金丝桃素均显著抑制了高K刺激的细胞内钙的升高;4.金丝桃素增强胰岛β-细胞活力:20nM、200nM、2μM的金丝桃素孵育INS-1细胞,24h后,MTT法检测细胞活力。结果表明:在200nM和2μM两个浓度,金丝桃素可显著增强INS-1细胞的活力,与对照组相比,细胞存活率升高为113%和120%。利用RIN-m5f细胞系重复上述实验证明:2μM的金丝桃素可增强细胞活力,与对照组相比,细胞存活率升高至116%;5.金丝桃素对胰岛β-细胞系的高糖毒性保护作用:将未经金丝桃素处理组细胞的存活率设为100%,INS-1细胞实验结果表明,高糖毒性条件下,细胞存活率降为91%,200nM、2μM的金丝桃素显著促进了细胞的存活,使存活率分别达到103%和110%。利用RIN-m5f进行同样的实验,结果表明:高糖条件显著抑制率细胞活力,细胞存活率降为82%,2μM金丝桃素则可显著促进RIN-m5f细胞的存活,使存活率达到91%;6.金丝桃素对胰岛β细胞系的高脂毒性保护作用:高脂毒性模型采用三个浓度的PA即100μM、200μM、3000μM处理细胞,INS-1细胞的存活率分别降低为对照组的97%、90

关键词：钙离子筛药模型灌流模型金丝桃素胰岛素分泌胰岛β细胞保护作用

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细胞因子小分子模拟物研究进展

药学学报 2000年第11期35卷 874-878页

作者：刘卫京吕秋军军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室北京100850

本文以国外有关论文为基础,结合本实验室的工作,进行分析、归纳和整理，综述了激活细胞因子受体的小分子激动剂和阻断细胞因子与其受体或信号转导途径下游部分相互作用的小分子拮抗剂的作用机制，讨论细胞因子受体的激活与阻断机制，为... 详细信息

本文以国外有关论文为基础,结合本实验室的工作,进行分析、归纳和整理，综述了激活细胞因子受体的小分子激动剂和阻断细胞因子与其受体或信号转导途径下游部分相互作用的小分子拮抗剂的作用机制，讨论细胞因子受体的激活与阻断机制，为发现与优化先导化合物提供可行的方案，为我国细胞因子小分子模拟物的研究提供参考。

关键词：细胞因子小分子模拟物筛药模型

一个简捷的甾体5α-还原酶抑制剂体外筛选模型

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上海实验动物科学 2002年第4期22卷 204-208页

作者：孙祖越吴建辉屠曾宏朱焰钟恩宏上海市计划生育科学研究所计划生育药具国家重点实验室中国科学院上海生命科学院药物研究所

通过模拟睾丸酮经甾体5α-还原酶催化,从NADPH(辅酶)中获得H^+还原成双氢睾丸酮(DHT)这一反应,参照文献资料以酶动力学原理,分别测定反应底物NADPH和产物[~3H]-DHT含量变化的初始速率以代表酶活性,建立了“分光光度计法”和“同位素法... 详细信息

通过模拟睾丸酮经甾体5α-还原酶催化,从NADPH(辅酶)中获得H^+还原成双氢睾丸酮(DHT)这一反应,参照文献资料以酶动力学原理,分别测定反应底物NADPH和产物[~3H]-DHT含量变化的初始速率以代表酶活性,建立了“分光光度计法”和“同位素法”体外筛药模型,通过这两种模型对比,以非那甾胺为阳性对照药物,对爱普列特进行了体外模型验证研究。两种筛选模型结果一致,确定非那甾胺和爱普列特的抑制常数:用测定OD_(340)nm值的“分光光度计法”求得爱普列特抑制常数Ki=24.9±1.3nmol/L,半数抑制浓度IC_(50)=39.0 nmol/L;非那甾胺Ki=15.3±2.3 nmol/L,IC_(50)=58.6 nmol/L。用测定[~3H」-DHT dpm值的“同位素法”求得爱普列特Ki=67.4±13.2 nmol/L,IC_(50)=49.6nmol/L;非那甾胺Ki=25.0±1.9 nmol/L,IC_(50)=5.1nmol/L。该结果与国外文献中报道的爱普列特Ki=5～23 nmol/L,非那甾胺Ki=23.6 nmol/L相接近。

关键词：大鼠爱普列特前列腺增生筛药模型甾体5α-还原酶抑制剂体外筛选模型

抗结核新型化合物的筛选、初步评价及表面展示SIV Gag抗原的重组耻垢分枝杆菌的构建

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抗结核新型化合物的筛选、初步评价及表面展示SIV Gag抗原的重组...

作者：王邦兴安徽大学

学位级别：硕士

结核病(Tuberculosis, TB)是全球危害最大的传染病之一。耐药TB的出现及TB与艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)共感染使人类对抗TB新药的需求更为迫切。然而传统的抗TB药物研发模式所需周期长、成本高,在长达40多年的时间... 详细信息

结核病(Tuberculosis, TB)是全球危害最大的传染病之一。耐药TB的出现及TB与艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)共感染使人类对抗TB新药的需求更为迫切。然而传统的抗TB药物研发模式所需周期长、成本高,在长达40多年的时间里,没有抗TB新药诞生。本实验利用新型的抗TB药物筛选模型,成功的筛选到一种化合物(5k),在体内和体外的评价中都表现出良好的杀菌活性。利用该模型,可以在体内外连续检测同一样品,实验过程中不需要添加任何底物,仅需3-5天便可以对药物活性进行快速评价,灵敏度高,重复性强。在活性检测中：使用无抗性的自主发光的H37Ra (Selectable Marker-free Autoluminent Mycobacterium tuberculosis H37Ra, UAIRa)对一系列化合物进行初筛,筛选出包括5k在内的数十个具有体外杀菌活性的新型化合物;用无抗性自主发光的H37Rv (Selectable Marker-free Autoluminent Mycobacterium tuberculosis H37Rv, UAlRv)对这些化合物的杀菌活性做进一步验证,发现5k的体外杀菌效果较好;并且对于临床耐药菌株,5k也有较好的杀菌活性。在体内对于药物活性的检测中,使用不同剂量的5k对感染UAIRa的BALB/c小鼠进行治疗,发现5k在体内也表现出较强的杀菌效果,其杀菌效果与药物剂量呈正相关性,并且没有表现出体内毒性。初步的体内评价表明5k有希望成为抗TB新药。自人类首次发现艾滋病以来,科研人员一直致力于研发一种安全有效的HIV疫苗。科研人员经过30多年潜心研究,提出HIV疫苗需要诱发机体多重免疫反应。这样,疫苗诱导产生的抗体可以在病毒感染时中和部分病毒,其后以细胞免疫应答为主的免疫反应能够清除被病毒感染的细胞,从而降低HIV载量,并减少HIV的传播效率,达到预防与治疗的双重目的。近年来,由于性传播途径成为HIV传播的主要方式,所以能够诱发机体粘膜免疫反应的分枝杆菌疫苗载体在疫苗研发中越来越受到重视。将HIV-1的Env抗原展示在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, Msmeg)表面,构建HIV疫苗,检测发现,该疫苗可以诱发机体长期的粘膜免疫反应,并且抗原表达在表面的免疫效果好于抗原表达在胞内。对HⅣ患者体内的免疫应答和病毒载量进行比较,可以发现只有当针对Gag的反应更强时,病毒载量才会下降。基于以上成果,本实验选择了三种不同载体蛋白的表面展示系统,在新型的无任何毒力的Msmeg疫苗载体的表面展示SIV Gag抗原,构建重组菌株。

关键词：结核病筛药模型 HIV 表面展示疫苗

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中药质量标准体系能诞生吗?

科技潮 2001年第9期 58-58页

“一个几百亿的庞大市场,竟然没有一个完善成熟的质量标准体系,药物成分不明、机理不清是主要障碍,而筛药技术和筛药模型又是最大的瓶颈。”上海联合基因科技公司副总裁樊宏说。他说:中国几千年来中药没有质量标准体系的历史将被改写,... 详细信息

“一个几百亿的庞大市场,竟然没有一个完善成熟的质量标准体系,药物成分不明、机理不清是主要障碍,而筛药技术和筛药模型又是最大的瓶颈。”上海联合基因科技公司副总裁樊宏说。他说:中国几千年来中药没有质量标准体系的历史将被改写,中药走向国际市场的局面将被打开。这是一个具有划时代意义的创举。不久前,“抗肿瘤药筛选模型”由上海联合基因科技公司开发成功,世界首个投入实际应用的基因技术筛药中心随之宣告建立。中科院分院刘新垣院士、陈凯先院士等专家给出了异乎寻常的评价:“

关键词：基因筛药法中药质量标准体系筛药模型