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大黄欧文氏菌的等离子体诱变及产异麦芽酮糖的优化探究

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大黄欧文氏菌的等离子体诱变及产异麦芽酮糖的优化探究

作者：彭丹丹河南工业大学

学位级别：硕士

异麦芽酮糖(Isomaltulose)是蔗糖异构酶(sucrose isomerase,简称SIase,EC5.***.99.11)以蔗糖为原料,通过分子内转糖基化生成的一种非致癌的还原性二糖,具有水解速度慢、抗龋齿、低GI(血糖生成指数)、预防肥胖等功效。常压室温等离子体(atm... 详细信息

异麦芽酮糖(Isomaltulose)是蔗糖异构酶(sucrose isomerase,简称SIase,EC5.***.99.11)以蔗糖为原料,通过分子内转糖基化生成的一种非致癌的还原性二糖,具有水解速度慢、抗龋齿、低GI(血糖生成指数)、预防肥胖等功效。常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变因其高效、安全的特点已被广泛应用于微生物育种中以改善微生物的催化性能,细胞固定化技术则可提高生物催化剂的稳定性和重复使用率。本研究以一株能产异麦芽酮糖的大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)YS-1为研究对象,开展了菌株的ARTP诱变,选育高SIase酶活的突变菌株,研究了突变菌株最佳生长、发酵产酶条件以提高SIase酶活,对突变菌株的游离细胞和固定化细胞生产异麦芽酮糖的条件进行优化探究,以提高异麦芽酮糖产量,为工业应用奠定基础。具体研究内容如下:(1)通过ARTP诱变技术诱变大黄欧文氏菌YS-1,确定诱变条件为电源功率300 W、温度28°C、照射距离2 mm、工作气体流量12.0 L/min,照射处理时间50 s。经初筛和摇瓶复筛,最终从528株突变菌株中获得突变目的菌株DXW-60,SIase酶活为原始菌株的15.81倍,且传代8次后酶活稳定。与原始菌株的SIase基因序列进行比对,该基因未发生突变,推测可能是SIase的调控序列发生改变,使酶的表达水平提高所致。(2)对突变菌株的生长及产酶条件进行优化,基于培养基成分和培养条件的单因素试验结果,设计响应面试验进一步确定最佳产酶条件为:蔗糖浓度77.6 g/L,蛋白胨浓度5.0 g/L,磷酸氢二钠浓度3.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,p H 6.0,装液量100m L/250 m L,发酵时间12.5 h。此条件下菌株生长旺盛,SIase酶活最高为45.88U/m L,较优化前突变菌株的SIase酶活(21.18 U/m L)提高了1.17倍。(3)对DXW-60游离细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖的条件进行研究,包括细胞用量、底物浓度、p H和温度。研究表明,0.30 g湿菌体,700 g/L的底物浓度,自然p H,温度为40°C的条件下,可得到85.86%的异麦芽酮糖产率。与原始菌株相比,酶活的提高使DXW-60的转化效率更高,转化时间更短。但DXW-60游离细胞的重复利用性差,使用3批后异麦芽酮糖产率显著降低(P<0.05),因此考虑对其进行固定化操作,优化其重复利用性。(4)通过对比不同固定化细胞的机械强度、传质性能及制备工艺的繁琐度,最终选择了海藻酸钠-羧甲基纤维素钠复合载体固定DXW-60,并对其固定化条件进行研究。最佳固定化细胞的条件为:海藻酸钠添加量3%(W/V),羧甲基纤维素钠添加量0.4%(W/V),交联剂Ca Cl浓度0.1 mol/L,细胞包埋量10%(W/V),固定化时间30min。在此条件下固定化细胞具有最短的转化时间(6 h)和最高的转化速率。相较于DXW-60的游离细胞重复使用3批异麦芽酮糖产率降低至69.53%,DXW-60的固定化细胞重复利用率良好,连续使用7批,转化能力较为稳定,使用第7批异麦芽酮糖产率仍可达到71.60%。

关键词：异麦芽酮糖蔗糖异构酶等离子体诱变发酵优化固定化细胞

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等离子体诱变选育高产胞外多糖花脸香蘑菌株

生物技术通报 2021年第11期37卷 119-124页

作者：范敏王丽宁广东省科学院生物工程研究所广州510316 广东工业大学轻工化工学院广州510006

花脸香蘑多糖具有较大的药用价值,选育高产多糖花脸香蘑菌株可丰富种质资源并促进花脸香蘑多糖科技创新和产业发展。以花脸香蘑原生质体单核体菌株LS01_10作为出发菌株,利用等离子体诱变技术选育高产胞外多糖的花脸香蘑菌株。在诱变功率... 详细信息

花脸香蘑多糖具有较大的药用价值,选育高产多糖花脸香蘑菌株可丰富种质资源并促进花脸香蘑多糖科技创新和产业发展。以花脸香蘑原生质体单核体菌株LS01_10作为出发菌株,利用等离子体诱变技术选育高产胞外多糖的花脸香蘑菌株。在诱变功率为200 W,诱变时间为60 s的条件下,共获得5个性状稳定遗传的高产胞外多糖诱变菌株,其胞外多糖的产量是出发菌株的1.2-2.4倍。诱变菌株的菌丝形态和颜色都发生不同程度改变,且生物量均高于出发菌株。ISSR实验结果表明,诱变菌株与出发菌株相比在遗传水平发生不同程度的改变。高产多糖诱变菌株为进一步解析多糖高产机制提供了重要的菌种资源。

关键词：花脸香蘑等离子体诱变胞外多糖

等离子体诱变与化学诱导下海洋真菌次生代谢产物研究

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等离子体诱变与化学诱导下海洋真菌次生代谢产物研究

作者：鲍海燕大连交通大学

学位级别：硕士

海洋生物的次生代谢途径不同于陆地生物,其中对海洋真菌次生代谢产物的研究越来越受到天然产物化学界的重视。海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的活性物质,它们多为生物碱类、萜类、大环内酯类化合物、不饱和脂肪酸、多肽、环肽、聚醚类、... 详细信息

海洋生物的次生代谢途径不同于陆地生物,其中对海洋真菌次生代谢产物的研究越来越受到天然产物化学界的重视。海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的活性物质,它们多为生物碱类、萜类、大环内酯类化合物、不饱和脂肪酸、多肽、环肽、聚醚类、醌类、毒素、多糖、酶类等。许多物质具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗氧化、抗炎、酶及酶的抑制活性、抗寄生虫、抗过敏反应等作用,这些化合物的发现为药物研究提供了重要的先导化合物。本论文选取了爪曲霉Aspergillus unguis DLEP2008001为出发菌株,对其经介质阻挡放电等离子体诱变得到的菌株6-20-6采用M-PSB培养进行了 10 L规模的发酵,另外对出发菌株还采用Plocain-NaBr-PSB培养基进行了 20L规模的化学诱导发酵,对它们的发酵粗提物进行分离纯化,分离方式有Sephadex LH20凝胶柱,硅胶柱,反相柱,液相制备等,利用核磁共振波谱、质谱等方式进行化合物结构鉴定,共分离化合物11个,鉴定了 8个,并对分离得到的部分化合物进行了初步的生物活性筛选。从诱变菌株6-20-6发酵提取物中,共分离鉴定到6个化合物,均为缩酚酸环醚类化合物。对这部分化合物进行了抗菌活性、DPPH自由基清除活性、抑制乙酰胆碱酯酶活性研究,结果表明这些缩酚酸环醚类化合物具有较弱或中等的抗菌、抗老年痴呆的活性。本论文研究表明,等离子诱变和化学诱导这些高效诱变与诱导手段,能刺激菌株产生更多样化的新颖结构活性先导化合物,充分发掘菌株的代谢潜能,为解决海洋药物研究的药源瓶颈问题以及大量新结构候选化合物的来源供给探索了新的途径,并为今后深入进行活性物质生物合成途径及诱变与诱导的生物学机制的研究工作奠定基础。

关键词：海洋真菌次生代谢产物生物活性结构鉴定等离子体诱变化学诱导

常压室温等离子体诱变绿色产色链霉菌及阿维拉霉素高产菌选育

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中国抗生素杂志 2015年第10期40卷 732-737页

作者：向荣华詹晓北朱莉郑志永吴剑荣江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡214122 江苏瑞光生物科技有限公司无锡214125

目的筛选获得阿维拉霉素高产菌株。方法对一株绿色产色链霉菌实施常压室温等离子体诱变,以中间产物类似物氨基丁酸和高浓度的Ca Cl_2为筛选因子,结合统计学分析,通过琼脂块移接法初筛和管碟法复筛。结果获得一株高产阿维拉霉素的绿色产... 详细信息

目的筛选获得阿维拉霉素高产菌株。方法对一株绿色产色链霉菌实施常压室温等离子体诱变,以中间产物类似物氨基丁酸和高浓度的Ca Cl_2为筛选因子,结合统计学分析,通过琼脂块移接法初筛和管碟法复筛。结果获得一株高产阿维拉霉素的绿色产色链霉菌D60-9-20,经摇瓶发酵后,HPLC检测发酵液中阿维拉霉素产量达到545mg/L,较出发菌株产量提高了232%,并具有稳定的遗传性能。结论常压室温等离子体诱变能有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,得到的绿色产色链霉菌菌株D60-9-20具有生产阿维拉霉素的潜在应用价值。

关键词：阿维拉霉素绿色产色链霉菌等离子体诱变

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紫外-等离子体复合诱变红曲霉产胞外多糖

食品与发酵工业 2016年第1期42卷 64-69页

作者：蒋汶张庆庆汤文晶程亚运安徽工程大学生物与化学工程学院安徽芜湖241000

以红曲霉ZL307为出发菌株,采用紫外结合常压室温等离子体的复合诱变方法对其进行诱变。紫外诱变条件为:照射距离15 cm,功率15 W,时间90 s。等离子体诱变条件为:照射距离3 mm,注入气体氦气,气流量10 L/min,功率200 W,时间180 s。筛选得... 详细信息

以红曲霉ZL307为出发菌株,采用紫外结合常压室温等离子体的复合诱变方法对其进行诱变。紫外诱变条件为:照射距离15 cm,功率15 W,时间90 s。等离子体诱变条件为:照射距离3 mm,注入气体氦气,气流量10 L/min,功率200 W,时间180 s。筛选得到具有良好遗传稳定性的菌株ZJ307-3,与原始菌株相比,发酵周期没有发生明显的改变,7 d时多糖产量达到550.07 mg/L,提高61.18%。复合诱变菌株多糖产量较单紫外诱变菌株提高27.58%,较单等离子体诱变菌株提高12.55%。

关键词：红曲霉胞外多糖紫外诱变等离子体诱变

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常温等离子体诱变选育高效耐镉硫酸盐还原菌

西北大学学报（自然科学版） 2015年第2期45卷 303-307页

作者：朱晓丽张建霞徐雅雅姚倩李梦董立萍西北大学城市与环境学院陕西西安710127

从镉污染土壤中分离出35株硫酸盐还原菌(SRB),采用优化的硫酸钡沉淀法测定其硫酸盐还原活性,筛选出3株在缺氧和有氧条件下硫酸盐还原活性均较高的菌株,采用常温等离子体诱变技术对筛选的菌株进行诱变处理,筛选出一株硫酸盐还原活性高且... 详细信息

从镉污染土壤中分离出35株硫酸盐还原菌(SRB),采用优化的硫酸钡沉淀法测定其硫酸盐还原活性,筛选出3株在缺氧和有氧条件下硫酸盐还原活性均较高的菌株,采用常温等离子体诱变技术对筛选的菌株进行诱变处理,筛选出一株硫酸盐还原活性高且耐受Cd生长能力强的诱变株WK 2-5-2,该菌株在液体培养基中能够耐受100mg/L Cd2+生长,菌数达到4.12×107CFU/m L,比其原始菌株WK 2-5的数量增加了约100倍。该菌株在缺氧和有氧条件下的硫酸盐还原活性分别为99.17%和78.37%,比其相应的原始菌株WK 2-5的硫酸盐还原活性分别增加了1.49%和43.88%。通过测定WK 2-5-2的16S rRNA序列,该菌株与路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii EN-119)同源性达到100%,初步鉴定该菌株为路德维希肠杆菌。该菌株具有应用于镉污染土壤或水体修复的潜力。

关键词：硫酸盐还原菌镉污染土壤等离子体诱变

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产共轭亚油酸菌株的筛选及其等离子体诱变

工业微生物 2016年第5期46卷 50-54页

作者：孙丽慧王庆山赵淑艳修志龙大连理工大学食品与环境学院辽宁盘锦124221 大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024

本实验从东北酸菜汁中筛选获得了一株产共轭亚油酸能力较好的菌株SC-05,特别是气相色谱分析结果表明,合成的CLA产物构型为单一构型,仅为c9,t11-18:2-CLA,经鉴定该菌为乳杆菌属Lactobacillus sp.。菌株SC-05经低温等离子体处理后,筛选出... 详细信息

本实验从东北酸菜汁中筛选获得了一株产共轭亚油酸能力较好的菌株SC-05,特别是气相色谱分析结果表明,合成的CLA产物构型为单一构型,仅为c9,t11-18:2-CLA,经鉴定该菌为乳杆菌属Lactobacillus sp.。菌株SC-05经低温等离子体处理后,筛选出突变株A-08,其共轭亚油酸产量达到119.24μg/m L,比出发菌株增加了83.0%,且突变株A-08具有较好的遗传稳定性。

关键词：共轭亚油酸筛选乳杆菌属等离子体诱变

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利用等离子体诱变技术选育多杀菌素高产菌株

利用等离子体诱变技术选育多杀菌素高产菌株

作者：赵徐平河北大学

学位级别：硕士

多杀菌素为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的次级代谢产物,是一种新型生物杀虫剂,因其安全、高效的特点,已在多个国家广泛使用。本研究首先对实验室保藏的多杀菌素生产菌株B进行自然分离纯化,得到遗传稳定的菌株B7,其... 详细信息

多杀菌素为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的次级代谢产物,是一种新型生物杀虫剂,因其安全、高效的特点,已在多个国家广泛使用。本研究首先对实验室保藏的多杀菌素生产菌株B进行自然分离纯化,得到遗传稳定的菌株B7,其多杀菌素产量为195.43μg/m L(40 m L/250 m L发酵瓶),选定该菌作为本研究诱变育种的原始出发菌株。本研究分别采用浅蓝菌素、丙酸钠、磷酸二氢钾、2-脱氧-D-葡萄糖作为筛选剂,定向筛选不同抗性的突变株,以提高育种效率。通过筛选剂耐受性实验,确定浅蓝菌素筛选浓度为30μg/m L,丙酸钠筛选浓度为4 mg/m L,磷酸二氢钾筛选浓度为30mg/m L,2-脱氧-D-葡萄糖筛选浓度为32 mg/m L。以菌株B7为原始出发菌株,进行了四轮常压室温等离子体(ARTP)诱变,诱变工作气体为99.99%高纯氦气(He)。根据各剂量致死率及正突变率关系确定等离子体诱变最佳剂量区间为50-70 s,筛选效率最高的抗性压力为丙酸钠。经四轮诱变筛选得到遗传稳定的菌株4-50-6,其多杀菌素产量为375.85μg/m L(40 m L/250 m L发酵瓶),较原始出发菌株的产量增加了92.32%。利用以99.99%高纯氮气(N)为工作气体的多功能等离子体诱变系统(MPMS)对菌株4-50-6进行等离子体、紫外线复合诱变,等离子体诱变剂量为10-40 s,紫外线照射剂量为30 s,以丙酸钠为筛选剂获得遗传稳定的菌株5-35-19,其多杀菌素产量为441.86μg/m L(40 m L/250 m L发酵瓶),较原始出发菌株产量增加了126.10%。诱变选育过程中对突变株菌落形态及产量关系进行了研究,确定了菌落形态与多杀菌素产量具有一定的相关性。根据其对应关系进行正突变株的筛选,从而提高了筛选效率。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌抗性筛选等离子体诱变

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常压室温等离子体诱变选育核黄素高产突变株

发酵科技通讯 2020年第1期49卷 58-62页

作者：祝金山吴烨飞陆建卫浙江钱江生物化学股份有限公司浙江嘉兴314400

以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌QJVB-1为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,通过平板初筛,摇瓶发酵复筛,得到一株核黄素产量高、遗传性状稳定的突变株QJVB-2-91。摇瓶发酵结果表明:突变株核黄素最高产量达到9447 mg/L,较出发菌... 详细信息

以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌QJVB-1为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,通过平板初筛,摇瓶发酵复筛,得到一株核黄素产量高、遗传性状稳定的突变株QJVB-2-91。摇瓶发酵结果表明:突变株核黄素最高产量达到9447 mg/L,较出发菌株提高16.8%,发酵周期缩短6 h。5 L罐发酵结果表明:突变株核黄素最高产量达22001 mg/L,较出发菌株提高15.4%,发酵周期缩短6 h。经5次连续传代实验,突变株QJVB-2-91核黄素合成水平没有下降,可见突变株QJVB-2-91较出发菌株发酵水平显著提高,遗传性状稳定,发酵周期缩短,为产业化水平提高提供了坚实基础。

关键词：核黄素常压室温等离子体诱变菌种选育