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人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的检测方法

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吉林大学学报（理学版） 2018年第4期56卷 1017-1023页

作者：崔玉伟牟颖马莉丁雄方宗宇王焰吴青青贵州医科大学附属医院中心实验室贵阳550004 浙江大学工业控制技术国家重点实验室智能系统与控制研究所分析仪器研究中心杭州310058

应用等温多自配引发扩增(IMSA)技术,分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物,并在检测体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂,建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法.结果表明... 详细信息

应用等温多自配引发扩增(IMSA)技术,分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物,并在检测体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂,建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法.结果表明:340μmol/L HNB与1∶10 000SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色,阴性反应管双荧光显色为橘红色;该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL,可特异性检出样品中HPV16和HPV52,与临床检测结果比对无差异.

关键词：人乳头瘤病毒16型人乳头瘤病毒52型等温多自配引发扩增双荧光

基于双荧光等温DNA扩增技术的HPV检测方法研究

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基于双荧光等温DNA扩增技术的HPV检测方法研究

作者：崔玉伟贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究拟整合等温DNA扩增技术和微流控芯片技术的特色与优势,建立一种适合于基层及欠发达地区医疗卫生机构的HPV分型方法,为HPV筛查及进一步研究HPV病毒载量与宫颈病变的关系提供新的工具。方法:1.双荧光等温多自配引发扩增(IMSA)... 详细信息

目的:本研究拟整合等温DNA扩增技术和微流控芯片技术的特色与优势,建立一种适合于基层及欠发达地区医疗卫生机构的HPV分型方法,为HPV筛查及进一步研究HPV病毒载量与宫颈病变的关系提供新的工具。方法:1.双荧光等温多自配引发扩增(IMSA)法检测HPV16、52型。1)针对HPV16E7和HPV52E6基因序列各设计6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60 min,在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合染料作为反应指示剂,以反应最终荧光颜色变化作为结果判断标准。2)利用该方法对系列稀释的HPV16和HPV52质粒进行灵敏度分析。3)用已知单重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的临床标本进行特异性分析。4)用已建立的等温多自配引发扩增(IMSA)技术与103例宫颈刮片临床标本进行比对验证。2.一种可用于HPV16型精确定量的数字LAMP微流控芯片。1)在PCR管中对HPV16进行双荧光环介导等温扩增(LAMP)反应,并分析其灵敏度和特异性。2)应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,制作了一种新型的可用于核酸精确定量的数字等温微流控芯片(60 mm′40 mm′4 mm)。3)建立适合数字微流控芯片的双荧光LAMP反应体系。4)观察数字LAMP微流控芯片自吸式进样流程。5)用已知单重感染HPV6、16、18、39、52、58、59的临床标本验证数字LAMP的特异性。6)用数字LAMP微流控芯片对浓度为6×1044 pg/μL的HPV16质粒DNA进行精确定量。结果:1.340μM HNB与1:10000 SYBR Green I混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455 nm蓝光激发下发生扩增的反应管双荧光显色为黄绿色,未发生扩增的反应管为橘红色;该方法对HPV16、52型检测限分别达到了60拷贝/反应和600拷贝/反应;可特异性检出样品中HPV16和HPV52;与临床检测结果比对无差异。2.在PCR管中双荧光LAMP对HPV16型的检测限为4×1044 pg/μL,并可特异性检出HPV16;制作的微流控芯片可实现自吸分液式进样,并可实现对HPV16型数字LAMP检测,150μM HNB与1:10000 SYBR Green I混合构建的双荧光指示剂在数字LAMP微流控芯片的微反应小室内具有明确的指示效果,455 nm蓝光激发下发生扩增的微反应小室双荧光显色为黄绿色,未发生扩增的微反应小室为橘红色;数字LAMP微流控芯片可实现HPV16型的精确定量,对浓度为6×1044 pg/μL的HPV16质粒DNA进行精确定量其浓度为163 copies/μL,并可特异性检出HPV16型。结论:1.本研究建立的HPV16、52型等温多自配引发扩增检测方法可用于HPV分型快速筛查,实现更简易明确的结果判读,适合基层医疗机构开展HPV基因筛查。2.本研究成功构建了可用于数字LAMP检测的微流控芯片,芯片满足数字化检测的各项需求,并且无需外接动力系统和微阀门,该芯片能够实现高危HPV16型的快速精确定量检测,并且特异性良好。

关键词：人乳头瘤病毒(HPV) 等温多自配引发扩增环介导等温扩增数字LAMP 微流控

新型等温核酸扩增技术（IMSA）的建立及其对传染病病原EV71、CVA16、H7N9和HIV-1的快速检测应用

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新型等温核酸扩增技术（IMSA）的建立及其对传染病病原EV71、CVA1...

作者：丁雄华南理工大学

学位级别：硕士

传染病是我国发展比较严重的疾病之一，如手足口病、艾滋病以及新近流行的人感染H7N9禽流感等。由于现阶段仍无有效的疫苗和特效药物，对病原的核酸检测成为预防和控制传染病的重要手段。目前，我国推荐传染病病原的核酸检测均是以PCR... 详细信息

传染病是我国发展比较严重的疾病之一，如手足口病、艾滋病以及新近流行的人感染H7N9禽流感等。由于现阶段仍无有效的疫苗和特效药物，对病原的核酸检测成为预防和控制传染病的重要手段。目前，我国推荐传染病病原的核酸检测均是以PCR技术作为平台，但该法在检测上耗时耗力或依赖于昂贵笨重的仪器，不利于在基层检疫或医疗机构中的应用。相比而言，以环介导等温扩增（LAMP）为代表的新方法因检测简单、快速以及高特异性高灵敏性，有着很强的基层应用潜力。然而，LAMP法受到专利的严格保护，导致现有检测试剂盒的实际价格相对偏高，制约了真正应用。于此，本研究发明了一种新型的等温扩增技术即等温多自配引发扩增（IMSA）。本研究基于IMSA技术，分别以实时浊度法和肉眼颜色判定法两种检测方式，建立了对手足口病原EV71和CVA16、人甲型流感H7N9和艾滋病病原HIV-1的快速检测。首先，针对EV71和CVA16的VP1基因、H7N9的H7基因和N9基因以及HIV-1的gag基因的保守序列，分别设计IMSA引物;紧接着，对IMSA的反应条件进行优化;然后，验证IMSA法的检测特异性以排除交叉反应;再就，利用人工构建模板对IMSA法的灵敏度进行评估，并与现有LAMP法进行对比。最后，将所建IMSA法应用到临床样本检测中，以进一步评估检测性能。研究结果表明，优化后的IMSA法具备很强的检测特异性，无交叉反应。在检测灵敏度上IMSA法不仅可媲美现有LAMP法，甚至具备比后者更高的最低检测线。这一结论在临床样本的检测上再次得到验证。同时，本研究详细论述了IMSA法，并探索了不同引物组合的扩增效果。结果显示，IMSA只有六条引物共同使用时才能表现出快速、高特异性高灵敏性的特点。而且，本研究通过产物酶切间接证明了IMSA反应的真实存在。总之，IMSA技术作为一种新型等温扩增技术，一方面打破了LAMP专利在我国的应用限制，另一方面也是对目前核酸体外扩增技术手段的改进和补充。它具备简单、快速、高灵敏性高特异性优势，能为基层传染病防控提供新的技术思路和选择，而且具备向食品安全检测、转基因成分检测以及生态物种保护等领域扩展的潜力。

关键词：核酸扩增技术等温多自配引发扩增病毒性病原快速检测

等温核酸扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒和鼻病毒的研究

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等温核酸扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒和鼻病毒的研究

作者：关丽中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

病毒性传染病,尤其是可经呼吸道感染的病毒性传染病,一直是全球公共卫生领域关注的焦点。一方面,以西尼罗病毒,埃博拉病毒为代表的已知病毒重新出现引起疾病暴发;另一方面,以中东呼吸综合征冠状病毒,H7N9禽流感病毒为代表的新发传染病... 详细信息

病毒性传染病,尤其是可经呼吸道感染的病毒性传染病,一直是全球公共卫生领域关注的焦点。一方面,以西尼罗病毒,埃博拉病毒为代表的已知病毒重新出现引起疾病暴发;另一方面,以中东呼吸综合征冠状病毒,H7N9禽流感病毒为代表的新发传染病不断出现。大多数病毒性传染病尚无有效的药物和疫苗,因此快速可靠的诊断方法的研发和应用成为预防和控制病毒性传染病的重要措施。目前,病原核酸检测方法大多基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)及其延伸技术,但该法耗时长且需要精密昂贵仪器,不适于在基层检验检疫或医疗卫生机构中使用。相比而言,等温核酸扩增技术,如环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification, LAMP),基因组指数扩增反应(Genome Exponential Amplification Reaction, GEAR)和等温多自配引发扩增(Isothermal multiple-self-matching-initiated amplification, IMSA)在恒温条件下即可发生扩增,具有快速、高特异性和灵敏度等特点,对硬件设备要求低,更适合基层检测工作的需要。首先,本研究基于上述三种等温扩增技术建立了对中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)这一新发病原体的检测方法。选择MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid, N)设计引物并在等温条件下(63℃)进行扩增反应。通过实时荧光法和颜色判定法进行检测结果判定。对多种人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,无交叉反应。对梯度稀释的体外转录MERS-CoV N;基因RNA进行了检测限分析,同时与美国CDC发表的实时荧光定量PCR (real time RT-PCR, rRT-PCR)进行了比较。结果显示,通过实时荧光法判读结果时,RT-LAMP和RT-GEAR检测限相当,为5×102拷贝/反应;RT-IMSA和rRT-PCR相当,为102拷贝/反应。通过颜色判定法判断结果时,RT-IMSA检测限为5×102拷贝/反应,而另外两种等温扩增方法均为103拷贝/反应。对含MERS-CoV N基因扩增区域的病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)进行检测时,RT-LAMP和RT-GEAR的灵敏度均为104拷贝/反应,而RT-IMSA的灵敏度可达103拷贝/反应,优于上述两种反应。因此,上述等温检测方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。其次,本研究基于GEAR技术建立了针对鼻病毒(Human rhino viruses, HRVs)的通用型等温扩增检测方法。针对HRVs的5’非翻译区(Untranslated region, UTR)基因设计4条特异引物,在等温条件下(65℃)进行60 min扩增反应,通过Genie(?) Ⅱ等温扩增仪收集荧光信号,实时监测扩增结果。采用常见肠道病毒和呼吸道病毒进行了特异性验证,无交叉反应;采用含HRV-A60、 HRV-B06、HRV-C07扩增区域的体外转录RNA进行了灵敏度评价,灵敏度分别为5,50和5拷贝／反应。通过与文献报道的半巢式PCR后产物测序方法同时检测143份临床标本,评价了该方法的临床检测效果。RT-GEAR的特异性和灵敏度分别为100%和98.08%,kappa值为0.985。结果显示,基于便携式Genie(?)II等温扩增仪的RT-GEAR等温核酸扩增检测方法是一种高效快速,可用于现场的HRVs通用型检测方法。综上所述,本研究成功建立了针对新发病原MERS-CoV的核酸快速等温扩增检测方法,为MERS-CoV感染诊断提供了快速有效手段,为检验检疫和医疗卫生部门的检测工作提供了技术支持,为应对国内可能发生疫情提供了技术储备,并具有在现场应用和向基层推广的潜力。此外,本文也建立了针对流行率最高的人类呼吸道感染病毒HRVs的通用型核酸等温扩增检测方法,可应用于HRVs所有基因型的检测,为HRVs感染诊断提供了普适、可靠和快速的手段,有助于其引起疾病的早期诊断进而防止严重并发症的发生。

关键词：环介导等温扩增基因组指数扩增反应等温多自配引发扩增中东呼吸综合征冠状病毒鼻病毒