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解剖学报 2014年第2期45卷 196-203页

作者：田晓红柏树令范军侯伟健佟浩徐赫中国医科大学基础医学院组织工程学教研室沈阳110001

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对人神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础。方法根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(s... 详细信息

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对人神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础。方法根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列。慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出最佳干扰序列进行后续实验。然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变。并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,最后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制。结果慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L。Real-time PCR检测结果显示,#3 shRNA为最佳的有效靶点。克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降。Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达。此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低。透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态。结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用。

关键词： RNA干扰端锚聚合酶1 神经母细胞瘤 Wnt β-catenin信号通路免疫印迹法人

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人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

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中国组织工程研究 2013年第28期17卷 5184-5190页

作者：杜华徐晓艳海玲师迎旭内蒙古医科大学基础医学院病理解剖学教研室内蒙古自治区呼和浩特市010059 内蒙古医科大学附属医院临床研究中心内蒙古自治区呼和浩特市010050 中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所天津市300020

背景:端粒相关蛋白直接影响端粒的功能,调节端粒DNA的长度,与细胞的衰老和癌变密切相关。目的:通过观察正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的变化来找寻细胞正常衰老过程中的关键调控分子。方法:在构建好的细胞复制性衰老模型基础上... 详细信息

背景:端粒相关蛋白直接影响端粒的功能,调节端粒DNA的长度,与细胞的衰老和癌变密切相关。目的:通过观察正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的变化来找寻细胞正常衰老过程中的关键调控分子。方法:在构建好的细胞复制性衰老模型基础上,利用RT-PCR与westernblot方法在分子与蛋白水平检测端粒相关因子的表达变化,主要检测人胚肺成纤维细胞在复制性衰老过程中端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA、端粒末端保护蛋白1以及P53的表达情况。结果与结论:结果显示,随着细胞的衰老,人端粒结合蛋白1的转录水平未发生改变,而人端粒结合蛋白1的蛋白表达水平有逐渐升高而后快速降低的过程;端锚聚合酶1的mRNA水平及蛋白表达水平未发生变化;端粒末端保护蛋白1随着人胚肺成纤维细胞的衰老表达水平逐渐降低;端粒酶RNA组分随着细胞的衰老呈递增趋势;P53的蛋白表达未发生变化。综上认为,人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1及端粒酶RNA在细胞的复制性衰老过程中起重要作用。

关键词：组织构建组织构建与生物活性因子复制性衰老端粒结合蛋白1 端锚聚合酶1 端粒末端保护蛋白1 端粒酶RNA P53 其他基金

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Tankyrase1反义寡核苷酸抑制肺癌细胞生长作用的基础研究

Tankyrase1反义寡核苷酸抑制肺癌细胞生长作用的基础研究

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作者：李翀天津医科大学

学位级别：硕士

在肿瘤细胞和永生化细胞中，端粒酶介导的端粒延长与端粒结合蛋白1(TRF1)对端粒长度的负调控作用之间处于动态平衡，使端粒维持在一特定长度。近来发现一种新的端粒酶系统调控酶—端锚聚合酶1(Tankyrasel，TANK1)，在细胞间期TANK1与TRF... 详细信息

在肿瘤细胞和永生化细胞中，端粒酶介导的端粒延长与端粒结合蛋白1(TRF1)对端粒长度的负调控作用之间处于动态平衡，使端粒维持在一特定长度。近来发现一种新的端粒酶系统调控酶—端锚聚合酶1(Tankyrasel，TANK1)，在细胞间期TANK1与TRF1结合共同定位于染色体末端，催化TRF1核糖基化而从端粒脱落，以便于端粒酶延伸端粒序列。该酶是调控端粒复制中最为明确的一环，是细胞癌变机制和癌症靶标研究的新热点。国外的研究现状为对TANK1结构及其细胞核内、外定位功能方面的探讨，少数学者报道了TANK1在某些恶性肿瘤中表达水平上调，并与hTERT(人端粒酶逆转录酶)的表达呈明显正相关。国内文献仅限于对该酶相关功能的综述性报道。国内、外罕见TANK1反义核酸作用于恶性肿瘤研究的相关文献报道。本课题旨在探讨TANK1反义寡核苷酸对人肺癌细胞系CALU增殖的影响。目的：探讨TANK1反义寡核苷酸对人肺癌细胞系CALU增殖的抑制情况，为肺癌基因治疗的靶标研究探索新途径。方法：设计合成TANK1正义寡核苷酸(TANK1-SODN)、反义寡核苷酸(TANK1-ASODN)，待人肺癌细胞株CALU裸鼠蹊部皮下接种成瘤后，将成瘤裸鼠随机分成3组：对照组4只，正义组与反义组各5只。采用瘤体多位点注射的方法观察实体瘤的生长情况及肿瘤组织学、电镜癌细胞超微结构的改变;免疫组织化学SABC(链霉亲和素-生物素-酶复合物)法检测3组肺癌细胞中Ki67(细胞核增殖抗原)与hTERT蛋白的阳性表达水平;hTERT TSP原位杂交SABC染色系统检测3组癌细胞中hTERT mRNA的阳性表达情况。结果： 1、TANK1-ASODN对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用连续注射15d后，反义组移植瘤生长抑制率为69.32％，疗效明显优于对照组(肿瘤呈进行性生长)和正义组(对肺癌细胞的抑制率小于40％)。处理第1d及第5d时3组移植瘤体积差异无显著性(P＞0.05);第10d对照组移植瘤体 Tankyrase反义寡核酸抑制人肺癌细胞系生长作用的基础研究积明显大于正义组(P0.05)。 3.2 hTERT蛋白的表达情况: 3组肿瘤组织中均有hTERT蛋白阳性表达。对照组、正义组肿瘤细胞染色质hTERT定位清楚，阳性程度高。反义治疗组肿瘤细胞呈现弱阳性表达，阳性细胞分布较稀少。3组裸鼠肿瘤细胞hTERT蛋白阳性表达率比较差异有非常显著性意义(x’二1246.50，P.05)。 4、原位杂交检测3组癌细胞hTERT mRNA表达情况 3组肺癌组织中均有表达hTERT mRNA的阳性肿瘤细胞。对照组、正义组肿瘤细胞胞浆染色阳性程度高，反义治疗组肿瘤细胞呈现弱阳性表达，阳性细胞 2 ，l加kyr

关键词：端锚聚合酶1 反义寡核苷酸人CALU肺癌细胞 TRF1 基因治疗

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