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不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

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中国组织工程研究与临床康复 2007年第50期11卷 10025-10029页

作者：刘德伍黄培信毛远桂陈剑平蓝蔚王联群南昌大学第一附属医院烧伤中心江西省南昌市330006

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发... 详细信息

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。

关键词：表皮干细胞端粒酶反转录酶发育阶段

人端粒酶反转录酶转染大鼠许旺细胞的生物学特性

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中国组织工程研究 2015年第14期19卷 2250-2254页

作者：刘琳琳邓为民天津医科大学基础医学院免疫学系天津市300070

背景:研究表明,基因修饰许旺细胞可使许旺细胞在体内存活时间延长,促进神经再生和功能的恢复。目的:以反转录病毒PLXSN为载体,将hT ERT基因转染入体外培养的大鼠许旺细胞,检测许旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性。方法:体外培养Wistar... 详细信息

背景:研究表明,基因修饰许旺细胞可使许旺细胞在体内存活时间延长,促进神经再生和功能的恢复。目的:以反转录病毒PLXSN为载体,将hT ERT基因转染入体外培养的大鼠许旺细胞,检测许旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性。方法:体外培养Wistar大鼠许旺细胞,经反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染,在同等条件下进行空载病毒转染,以正常培养的许旺细胞为对照组。采用RT-PCR,Western blot检测许旺细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。以细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用。结果与结论:人端粒酶反转录酶基因转染许旺细胞48 h后,检测到人端粒酶反转录酶mR NA和蛋白水平表达明显。与对照组和空载病毒组比较,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞数减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使许旺细胞端粒酶活性明显升高,能够促进体外培养的大鼠许旺细胞增殖。

关键词：干细胞培养端粒酶反转录酶许旺细胞基因转染大鼠细胞增殖细胞周期

携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

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中国组织工程研究 2015年第11期19卷 1707-1711页

作者：梁亮徐韬宋扬盛伟斌新疆医科大学第一附属医院脊柱外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 解放军第四军医大学唐都医院骨科陕西省西安市710038

背景:端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的:利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞... 详细信息

背景:端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的:利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞,并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法:原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组,转染后并测其转染率,且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论:端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示,端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明,携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。

关键词：基因细胞组织构建组织工程端粒酶端粒酶反转录酶慢病毒载体 RNA干扰星形胶质细胞转染凋亡脊髓损伤胶质瘢痕新疆维吾尔自治区自然科学基金

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

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中国组织工程研究 2014年第7期18卷 1057-1062页

作者：宋扬徐韬杨明坤盛伟斌新疆医科大学第一附属医院脊柱外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 四川省巴中市中心医院骨科四川省巴中市636600

背景:端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。目的:利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。方法:选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的... 详细信息

背景:端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。目的:利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。方法:选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。结果与结论:蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。

关键词：组织构建组织工程 RNA干扰端粒酶端粒酶反转录酶质粒载体星形胶质细胞短发夹RNA 脊髓损伤胶质瘢痕国家自然科学基金

miR-1182调控胃癌细胞人端粒酶反转录酶的分子机制及其对迁移能力的影响

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第三军医大学学报 2014年第10期36卷 1074-1077页

作者：张丹郝宁波唐波吕沐瀚谢睿胡长江汪苏敏杨仕明第三军医大学新桥医院消化内科重庆400037

目的研究miR-1182在胃癌细胞中调控人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的机制及对其迁移能力的影响。方法胃癌细胞MKN28中转染miR-1182类似物,qRT-PCR检测转染后细胞miR-1182的相对表达量,Western blot检测转染后细胞hTERT的表达变化;进一步通过生物信息学预测miR-1182与hTERT mRNA的结合位点,双荧光素酶实验分析miR-1182对hTERT mRNA的作用机制;Transwell实验检测转染miR-1182类似物对MKN28细胞体外迁移能力的影响。结果 qRT-PCR表明miR-1182组的miR-1182的相对表达量(10.168±2.645)明显高于对照组(1.008±0.167)(P酶实验表明miR-1182可与hTERT mRNA的ORF区结合,且其主要结合部位为hTERT mRNA的ORF-1;在Transwell迁移实验中,miR-1182类似物转染细胞后,miR-1182组穿膜细胞数为(23.333±4.509)/视野,对照组穿膜细胞数为(71.000±4.582)/视野,miR-1182组细胞迁移能力明显低于对照组(P转录后水平抑制hTERT的表达,并发现其可抑制胃癌细胞的迁移能力。

关键词：端粒酶反转录酶 miR-1182 胃肿瘤肿瘤转移

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

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中国组织工程研究 2012年第50期16卷 9357-9363页

作者：胡凡果史玉荣牛瑞芳刘彤只向成天津医科大学总医院普通外科天津市普通外科研究所天津市300000 天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室天津市300000 天津医科大学附属肿瘤医院乳腺三科天津市300000

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺... 详细信息

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P端粒酶活性出现显著下降(P端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。

关键词：乳腺癌端粒端粒酶端粒酶反转录酶端粒酶活性小干扰RNA RNA干扰小发夹RNA 组织构建

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

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中国组织工程研究 2014年第11期18卷 1724-1729页

作者：宋扬徐韬杨明坤王国旗张恩丰盛伟斌新疆医科大学第一附属医院脊柱外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 四川省巴中市中心医院骨科四川省巴中市636600

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶... 详细信息

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

关键词：组织构建组织工程组织构建基础实验 RNA干扰端粒酶端粒酶反转录酶质粒载体慢病毒星形胶质细胞短发夹RNA 脊髓损伤胶质瘢痕国家自然科学基金

妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘线粒体呼吸链酶活性和端粒酶反转录酶改变的研究

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上海医学 2013年第3期36卷 248-253,I0004页

作者：黄鼎程蔚蔚张慧娟刘特秦蕾上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院妇产科上海200030 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院病理科上海200030 上海中医药大学上海市中医老年医学研究所

目的研究胎盘滋养细胞线粒体呼吸链酶活性及端粒酶反转录酶(hTERT)的表达与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)的关系。方法选取27例ICP患者(ICP组)及18例正常孕妇(对照组),采用酶组织化学法分析各组胎盘滋养细胞中线粒体呼吸链酶活性,采用免疫... 详细信息

目的研究胎盘滋养细胞线粒体呼吸链酶活性及端粒酶反转录酶(hTERT)的表达与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)的关系。方法选取27例ICP患者(ICP组)及18例正常孕妇(对照组),采用酶组织化学法分析各组胎盘滋养细胞中线粒体呼吸链酶活性,采用免疫组织化学方法检测各组胎盘滋养细胞中hTERT的表达情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应定量检测各组胎盘中hTERTmRNA的表达情况。结果细胞色素c氧化酶、三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶在ICP组(包括ICP轻度亚组及ICP重度亚组)和对照组胎盘滋养细胞中的表达均呈阳性,ICP组上述酶活性均显著低于对照组(P值分别酶活性和hTERT表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。ICP组、ICP轻度亚组、ICP重度亚组及对照组hTERTmRNA的表达水平分别为3.10±0.12、3.32±0.13、2.66±0.22、2.76±0.08,18srRNA的表达水平分别为0.09±0.11、0.13±0.14、0.23±0.24、0.10±0.11,各组间hTERTmRNA和18srRNA表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 ICP患者胎盘绒毛受损,滋养细胞线粒体呼吸链酶活性下降,hTERT蛋白表达的增加无法弥补增多的细胞凋亡,机体失代偿,导致胎盘功能下降,这可能是ICP胎儿宫内缺氧的一种发生机制。

关键词：妊娠期肝内胆汁淤积症线粒体呼吸链酶端粒酶反转录酶胎盘

外周血人端粒酶反转录酶mRNA及四种肿瘤标志物检测在胃癌诊断中的价值

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肿瘤研究与临床 2019年第4期31卷 245-249页

作者：丽敏孙鲁山冯长梅宋佳春包头医学院研究生学院 014040 包头医学院第三附属医院检验科 014030 包头市第四医院检验科 014030 包头市肿瘤医院检验科 014030

目的探讨外周血人端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA与肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原72-4(CA72-4)、CA19-9、CA125单项、联合检测在胃癌诊断中的应用价值。方法收集包头市肿瘤医院2017年6月至2018年10月初次诊断为胃癌的48例患者为试验组... 详细信息

目的探讨外周血人端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA与肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原72-4(CA72-4)、CA19-9、CA125单项、联合检测在胃癌诊断中的应用价值。方法收集包头市肿瘤医院2017年6月至2018年10月初次诊断为胃癌的48例患者为试验组,同期50名健康体检者为健康对照组,全部受试者采集外周静脉血标本。反转录合成hTERT cDNA后,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hTERT基因段。电化学发光法检测CEA、CA72-4、CA19-9、CA125。计算各个标志物单项或联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比。对联合检测项目进行灵敏度及特异度的比较。结果外周血hTERT mRNA(P0.05)。hTERT mRNA表达与TMN分期、淋巴结转移及远处转移有关(均P0.05)。诊断指标计算结果显示,hTERT mRNA有较高灵敏度(84.8%)、特异度(82.7%)、准确度(83.7%)、阳性预测值(81.2%)、阳性似然比(4.90);CA72-4对胃癌诊断效果仅次于hTERT mRNA,其特异度(61.2%)、准确度(64.3%)、阳性预测值(45.8%)均较高。CA125、CEA、CA72-4、CA19-9、hTERT mRNA联合检测与hTERT mRNA、CEA、CA72-4、CA19-9联合检测的诊断性能相比,差异无统计学意义(P>0.05)。传统肿瘤标志物CEA、CA72-4、CA19-9联合检测时灵敏度为62.5%、特异度为80.0%,hTERT mRNA、CEA、CA72-4、CA19-9联合检测的灵敏度可提高至90.0%,特异度降低至67.5%,两种联合检测组合灵敏度改变差异有统计学意义(P=0.019),特异度改变差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血hTERT mRNA综合评价指标优于传统胃癌标志物,有望成为诊断胃癌的一种新型标志物。

关键词：胃肿瘤诊断端粒酶反转录酶肿瘤标记,生物学聚合酶链反应