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巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因鉴定与表达模式分析

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西南大学学报（自然科学版） 2023年第3期45卷 100-109页

作者：方云洪王珍戴建修程明明成禄艳黎思辰雷双丁莉莉潘琦冉春西南大学柑桔研究所重庆400712 重庆市荣昌区昌元街道办事处重庆荣昌402460 重庆市云阳县果品产业发展中心重庆云阳404500

为明确巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri)章鱼胺受体基因的分子特征,探明其药理学和生理功能,运用转录组数据和生物信息学软件分析并鉴定章鱼胺受体基因的cDNA全长,利用qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)比较... 详细信息

为明确巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri)章鱼胺受体基因的分子特征,探明其药理学和生理功能,运用转录组数据和生物信息学软件分析并鉴定章鱼胺受体基因的cDNA全长,利用qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)比较章鱼胺受体基因在巴氏新小绥螨不同发育阶段、不同温度及饥饿胁迫条件下的表达模式.结果表明:于转录组数据库筛选鉴定到6个章鱼胺受体基因,分别命名为NbOctα1R1,NbOctα1R2,NbOctTyrR,NbOctβ2R1,NbOctβ2R2,NbOctβ3R,其完整开放阅读框为936~1 983 bp,编码312~661个氨基酸,在进化关系上与西方静走螨(Galendromus occidentalis)最为接近.NbOctα1R1,NbOctα1R2,NbOctTyrR,NbOctβ2R1,NbOctβ3R都具备G蛋白偶联受体的典型特征.6个章鱼胺受体基因在巴氏新小绥螨不同螨态均有表达,且在幼螨和若螨中表达水平较高.在不同温度胁迫条件下,不同章鱼胺受体基因在成螨和幼螨中受低温、高温影响后,仅有NbOctβ2R1,NbOctβ2R2在高温时表达量上调,低温时表达量下调.饥饿胁迫诱导时,除NbOctβ3R表达量随饥饿时间延长而降低外,其余章鱼胺受体基因表达量在饥饿开始的不同时间段出现不同程度的增加,最终随饥饿时间进一步增加而下降.从巴氏新小绥螨转录组中鉴定到的6个章鱼胺受体基因,在不同发育阶段、不同温度和饥饿胁迫下其表达量存在差异,推测巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因在不同发育阶段和逆境胁迫中承担着不同的生理功能.

关键词：巴氏新小绥螨章鱼胺受体发育阶段温度饥饿胁迫

赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

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中国农业科学 2018年第7期51卷 1315-1324页

作者：刘小强蒋红波李慧敏熊英王进军西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重庆市市级重点实验室

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节... 详细信息

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP08198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉>酪胺(TA)>章鱼胺>多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。

关键词：赤拟谷盗章鱼胺受体表达模式生物活性生理功能

昆虫章鱼胺受体激动剂亚氨基杂环类化合物的构效关系与药效团研究

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化学与生物工程 2022年第6期39卷 28-32页

作者：林义峰黄成万幽兰巨修练刘根炎武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程教育部重点实验室新型反应器与绿色化学工艺湖北省重点实验室湖北武汉430205

昆虫章鱼胺受体(OAR)属于G蛋白偶联受体,是一类重要的杀虫剂靶标。基于美洲蟑螂OAR激动剂2-芳基亚氨基杂环类化合物的分子结构和生物活性,运用分子模拟的方法构建了该类化合物的三维定量构效关系(3D-QSAR)和药效团模型,系统分析了该类... 详细信息

昆虫章鱼胺受体(OAR)属于G蛋白偶联受体,是一类重要的杀虫剂靶标。基于美洲蟑螂OAR激动剂2-芳基亚氨基杂环类化合物的分子结构和生物活性,运用分子模拟的方法构建了该类化合物的三维定量构效关系(3D-QSAR)和药效团模型,系统分析了该类化合物作为OAR激动剂的构效关系。内外部参数均验证了3D-QSAR模型的可靠性和良好的预测能力;通过对3D-QSAR模型等势图分析发现,在苯环的环取代邻位引入体积较大的正电子基团和在苯环的环取代对位引入负电子基团都有可能提高该类化合物的活性;通过对药效团模型分析发现,所构建的最佳药效团模型是合理的,苯环和杂环作为2个疏水中心、2个氮原子作为2个正电中心可能与该类化合物对OAR产生活性具有重要作用。该研究结果为靶向OAR杀虫剂的设计和开发提供了重要信息。

关键词：章鱼胺受体杀虫剂 2-芳基亚氨基杂环三维定量构效关系药效团

合浦珠母贝章鱼胺受体(OAR)基因的克隆与表达分析

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南方水产科学 2017年第1期13卷 58-65页

作者：王德清李海梅黄桂菊张博范嗣刚刘宝锁苏家齐喻达辉中国水产科学研究院南海水产研究所农业部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

章鱼胺受体(octopamine receptor,OAR)广泛存在于无脊椎动物中,具有调节神经肌源性节奏收缩、调节c AMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能,但其在贝类中的研究却很少。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)OAR基因(pf OAR)的c DN... 详细信息

章鱼胺受体(octopamine receptor,OAR)广泛存在于无脊椎动物中,具有调节神经肌源性节奏收缩、调节c AMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能,但其在贝类中的研究却很少。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)OAR基因(pf OAR)的c DNA全长序列,比较分析了氨基酸序列的同源性,并采用荧光定量PCR技术检测了该基因在不同组织和幼体不同发育阶段的表达差异以及贝壳损伤后该基因在外套膜中表达水平的变化。结果显示:pf OAR的c DNA全长1 890 bp,开放阅读框1 659 bp,编码552个氨基酸,有7个跨膜结构域,具有G蛋白偶联受体的共性。pf OAR在6个被检测的组织中均有表达,且在外套膜中的表达水平显著高于其他组织;幼体发育过程中pf OAR表达水平逐渐升高,变态期的表达水平显著高于其他时期;人为损伤贝壳36 h后,pf OAR的表达水平显著升高。这些结果表明pf OAR在合浦珠母贝中可能具有多样化的功能,参与了贝壳的形成和修复,为进一步开展pf OAR的功能研究奠定了重要基础。

关键词：合浦珠母贝章鱼胺受体生物矿化变态发育缺刻实验

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棉铃虫章鱼胺受体2基因的分子鉴定

应用昆虫学报 2016年第5期53卷 972-981页

作者：吴凤明巫鹏翔王璇闫硕李贞张青文刘小侠中国农业大学昆虫系北京100193 中国科学院动物研究所北京100101 全国农业技术推广服务中心北京100125

【目的】为了探讨章鱼胺受体2基因(Octopamine receptor 2,OA2B2)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)体内表达谱及激素对其调控作用,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用,开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。【方法】本... 详细信息

【目的】为了探讨章鱼胺受体2基因(Octopamine receptor 2,OA2B2)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)体内表达谱及激素对其调控作用,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用,开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。【方法】本实验采用QRT-PCR技术、激素处理、RNAi介导的蜕皮激素相关核受体沉默等方法对Ha OA2B2受体基因在棉铃虫不同发育阶段及组织中的表达谱与激素调控进行探究。【结果】生物信息学分析表明,Ha OA2B2受体基因编码框长度1 191 bp,编码396个氨基酸。Ha OA2B2受体基因氨基酸序列与家蚕Bombyx mori一致性高达89%。Ha OA2B2受体基因在棉铃虫各时期均有表达,尤其在5龄第3天转录水平达到最高;Ha OA2B2受体基因在棉铃虫幼虫头部表达量最高。蜕皮激素可促进Ha OA2B2受体基因的表达。【结论】分析了该基因的序列特征和表达谱,蜕皮激素对其表达量的影响,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用以及开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。

关键词：棉铃虫章鱼胺受体蜕皮激素 RNA干扰

褐飞虱章鱼胺家族受体基因分析及药理学和生理功能研究

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褐飞虱章鱼胺家族受体基因分析及药理学和生理功能研究

作者：居晓敏南京农业大学

学位级别：硕士

章鱼胺(Octopamine,OA)是无脊椎动物体内一种重要的生物胺,对应于脊椎动物体内的去甲肾上腺素,参与调控昆虫生长发育、取食、代谢等多种生理行为过程,并使昆虫以合理的方式来应对外界刺激。在昆虫体内,OA主要是通过结合特异性的章鱼胺受... 详细信息

章鱼胺(Octopamine,OA)是无脊椎动物体内一种重要的生物胺,对应于脊椎动物体内的去甲肾上腺素,参与调控昆虫生长发育、取食、代谢等多种生理行为过程,并使昆虫以合理的方式来应对外界刺激。在昆虫体内,OA主要是通过结合特异性的章鱼胺受体(Octopamine receptors,OARs)来发挥作用。由于OA被认为主要是在无脊椎动物体内发挥重要功能,因此其所对应的受体被认为是新型杀虫剂开发的理想靶标而备受药理学家们关注。本研究中以农业害虫褐飞虱Nilaparvata lugens(Sta1)为研究对象,克隆得到了褐飞虱OARs家族的6个基因序列,利用qPCR技术分析了这6个基因在褐飞虱不同发育阶段和成虫不同组织中的表达模式,通过体外真核表达研究了NlOA2B2型受体的药理学特性,包括激动剂和拮抗剂谱,并通过药理学和遗传学RNAi技术明确了 NlOA2B2受体参与调控雌性褐飞虱产卵生理行为。一、褐飞虱章鱼胺受体家族基因克隆及序列分析通过将果蝇章鱼胺受体家族基因蛋白序列与褐飞虱基因组以及转录组数据进行TBLASTN比比对分析后,我们鉴定并克隆到褐飞虱5种OA受体,将其分别命名为NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B2、NlOA2B3、NlOA3(NlOA3-L 和 NlOA3-S),受体NlOA3基因通过可变剪切产生了 NlOA3-L和NlOA3-S两个转录本,在胞内三环上,NlOA3-LL比NlOA3-S多8个氨基酸。跨膜域预测结果表明,这些受体具有G蛋白偶联受体(GPCRs)的典型特征,均存在7个跨膜域(TM1-TM7)、3个胞内环、3个胞外环、胞内C端和胞外N端。生物信息学分析表明,褐飞虱章鱼胺家族受体也存在在其他昆虫章鱼胺受体中被预测和证实的磷酸化位点、糖基化位点、棕榈酰化位点以及配体结合位点等保守的结构域。氨基酸同源性分析表明褐飞虱章鱼胺受体家族基因与其他昆虫同源基因之间的同源性非常高,同源性在50%～70%之间。基因结构分析表明,除未比对到完整基因组序列的NlOA1基因和未克隆到全长的NlOA2B3基因外,NlOA3基因的CDS区具有最多的外显子/内含子结构。二、褐飞虱章鱼胺受体家族基因的表达模式分析通过荧光定量PCR的方法,对褐飞虱体内克隆得到的6个章鱼胺受体基因进行表达模式分析。从研究结果可以看出,在褐飞虱不同的发育阶段中,NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B2、NlOA2B3、NlOA3-L和NlOA3-S基因在整个发育周期中均可以检测到,其中,基因 NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B3、NlOA3-L 和 NlOA3-S 在卵期及 1-2 龄的低龄若虫阶段表达水平较高,之后随着龄期发育均出现逐渐降低的趋势,成虫期最低,而在成虫阶段,雄虫体内的表达水平均高于雌虫,但NlOA2B2基因在卵期和低龄若虫阶段表达水平低于成虫阶段,在雄虫体内表达水平却是最高的。在褐飞虱成虫期不同组织中,6个基因均是在褐飞虱脑组织中表达水平最高,在肠、脂肪体、马氏管、血淋巴中的表达水平各不相同。NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B3、NlOA3-L、NlOA3-S基因还存在于雌雄虫生殖器官中,NlOA2B2基因在褐飞虱足中的表达水平仅低于脑组织。NlOA2B2基因在褐飞虱生殖器官卵巢、输卵管、交配囊和受精囊中的表达模式研究发现,在卵巢中表达水平最低,输卵管、交配囊及受精囊三者之间的表达水平无差异。三、褐飞虱NlOA2B2受体的药理学与生理学研究我们使用稳定表达NlOA2B2基因的HEK293细胞系,采用ELISA法测定了章鱼胺(OA)、酪酪胺(Tyramine,TA)、多巴胺(Dopamine,DA)、5-羟色胺(Serotonin,5-HT)四种生物胺对胞内cAMP的影响。OA和TA均能诱导胞内产生cAMP,而DA和5-HT刺激均无此反应。OA和TA的EC50分别为1.14×10-7M和1.36×10-6M,OA的效力约为TA的8倍。因此,可推断出褐飞虱NlOA2B2是一种典型的章鱼胺受体并且偶联胞内cAMP的产生。此外,我们还测定了激动剂Naphazoline和Clonidine对胞内cAMP的效力,其EC50值分别为1.22×10-7M和6.03×10-7M。在拮抗剂试验中,Epinastine,Mianserin,Phentolamine,Methiothepin,Butaclamol,Methysergide 可以显著地拮抗OA产生的效应,而Prazosin Chlorpromazine和Ketanserin对OA无拮抗作用。我们通过注射药物的方法来明确NlOA2B2是否参与调控褐飞虱的产卵行为,结果发现拮抗剂Epinastine和Phentolamine能显著降低褐飞虱的产卵量和产卵痕量,并且不影响褐飞虱的存活率。通过RNAi技术特异性的敲除NlOA2B2基因后,发现NlOA2B2基因在整头褐飞虱体内

关键词：褐飞虱章鱼胺受体表达模式药理学 RNAi 产卵行为

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巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因鉴定与功能分析

巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因鉴定与功能分析

作者：程明明西南大学

学位级别：硕士

巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri(Hughes),隶属寄螨目(Paratiformes),植绥螨科(Phytoseiidae),该螨世界分布范围广,可捕食叶螨、跗线螨、瘿螨等害螨以及蓟马、粉虱、蚜虫等微小昆虫,是目前我国应用最广泛的捕食螨之一。章鱼胺(Octopamin... 详细信息

巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri(Hughes),隶属寄螨目(Paratiformes),植绥螨科(Phytoseiidae),该螨世界分布范围广,可捕食叶螨、跗线螨、瘿螨等害螨以及蓟马、粉虱、蚜虫等微小昆虫,是目前我国应用最广泛的捕食螨之一。章鱼胺(Octopamine,OA)通过结合特异性的章鱼胺受体(Octopamine receptors,OARs),调控昆虫生长发育等多种生理过程,OARs也因此备受研究学者关注。已报道在多种昆虫体内克隆得到OARs并开展功能等相关研究,同时OARs也是良好的药剂如双甲脒(Amitraz,AMZ)靶标位点。开展巴氏新小绥螨OARs研究,在明确其生物学特性以及生理功能的基础上,可为培育以OARs为作用靶标的杀虫/螨剂抗性天敌提供理论基础。本研究根据巴氏新小绥螨转录组筛选得到6个章鱼胺受体基因,利用q PCR技术分析了这6个基因在巴氏新小绥螨不同发育阶段、不同温度和饥饿胁迫下的表达模式;通过高通量测序技术,对双甲脒LC剂量处理后巴氏新小绥螨进行表达谱测定,分析激动剂刺激下章鱼胺受体相关基因表达差异情况;在测定的转录组基础上,获得响应双甲脒胁迫的章鱼胺受体NbOctβ3R,通过RNAi技术分析生理功能。本研究取得如下成果:1.巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因克隆与序列分析通过高通量测序技术,构建巴氏新小绥螨转录组数据库。测序结果组装去冗后得到44,279个Unigene,总长度55,332,274 bp。长度在1 kb以上的Unigene有13,667个,占比30.86%。通过与NR、COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot和egg NOG数据库比对,得到17,336个有效注释。利用PCR技术,克隆得到巴氏新小绥螨OARs基因NbOctα1R1、NbOctα1R2、NbOct Tyr R、NbOctβ2R1、NbOctβ2R2、NbOctβ3R的cDNA序列。通过TMHMM网站在线预测6个蛋白序列的结构特征,除NbOctβ2R2外,其余5个基因的氨基酸序列均具有7个跨膜结构域,符合G蛋白偶联受体的典型特征。氨基酸同源性分析表明巴氏新小绥螨章鱼胺受体家族基因与其他无脊椎动物同源基因同源性较高。系统发育分析结果显示NbOctα1R1、NbOctα1R2、NbOct Tyr R与其他无脊椎动物的α-adrenergic-like octopamine receptors聚为一枝,NbOctβ2R1、NbOctβ2R2、NbOctβ3R与β-adrenergic-like octopamine receptors聚为一枝,亲缘关系非常近。2.巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因表达模式分析利用RT-qPCR技术,解析巴氏新小绥螨章鱼胺受体基因在不同发育阶段、不同温度下和饥饿胁迫下的表达模式。结果发现,6条基因在巴氏新小绥螨各个螨态中均有表达,在幼螨和若螨中表达水平较高。成螨中NbOctα1R2、NbOctβ2R1、NbOctβ2R2在30℃表达量上调,低温则诱导表达量下调。NbOctα1R1和NbOct Tyr R随着温度升高或降低表达下调,15℃时较20℃表达上调。NbOctβ3R在35℃时表达量最高。各基因在成螨和幼螨中受温度影响变化存在差异。幼螨中NbOctα1R1在20℃表达量最低,25℃最高。NbOctα1R2、NbOctβ2R2、NbOctβ2R1和NbOctβ2R2在20℃和30℃表达量高于对照,在15℃表达下调。NbOctβ3R受温度影响较大,25℃时表达量最高,15℃表达最低。饥饿胁迫诱导NbOctβ2R2表达上调,NbOctβ3R受饥饿胁迫影响较大,表达量持续下调。3.激动剂处理后章鱼胺受体与相关基因表达差异分析本章通过喷雾塔药膜法测定了双甲脒乳油对巴氏新小绥螨敏感品系的毒力方程,LC为1.24 mg·L。激动剂双甲脒LC剂量处理巴氏新小绥螨6 h和12 h后进行表达谱测序。结果表明,6 h处理组与对照差异表达上调基因226个,下调137个,其中获得注释基因249条。12 h处理组与对照差异表达上调基因313个,下调186个,其中获得注释基因353条。涉及翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白相关,翻译核糖体结构,重组和修复,信号转导机制,细胞内运输、分泌和囊泡运输等相关基因。在差异表达基因中比对得到一条章鱼胺受体基因NbOctβ3R,受双甲脒胁迫表达量上调,其信号转导通路上腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)表达上调,蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)表达下调;共10条差异表达细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)基因,上、下调各5个;1条谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferases,GST)基因表达下调。4.巴氏新小绥螨NbOctβ3R基因功能研究基于NbOctβ

关键词：巴氏新小绥螨章鱼胺受体表达模式双甲脒 RNAi

桔小实蝇章鱼胺受体基因BdOctβ1R和BdOctβ2R的生理功能及药理学特性研究

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桔小实蝇章鱼胺受体基因BdOctβ1R和BdOctβ2R的生理功能及药理学...

作者：李慧敏西南大学

学位级别：硕士

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel),隶属双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一类世界性的农业害虫,分布范围广,危害多种水果蔬菜。由于长期使用化学药剂防治,导致桔小实蝇的抗药性迅速发展,使传统的杀虫剂难以达到高效防控的目的。... 详细信息

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel),隶属双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一类世界性的农业害虫,分布范围广,危害多种水果蔬菜。由于长期使用化学药剂防治,导致桔小实蝇的抗药性迅速发展,使传统的杀虫剂难以达到高效防控的目的。因此,寻找新的药剂靶标,开发新型药剂成为目前研究的重点。章鱼胺octopamine(OA)作为昆虫体内一种重要的生物胺,在昆虫体内参与调节多种重要的生理活动,偶联多种信号转导系统,与细胞内外第二信使的传递关系密切。章鱼胺主要通过与其受体结合,发挥各种功能。已有研究表明,章鱼胺受体作为一类典型的G蛋白偶联受体,是许多杀虫剂的潜在作用靶标。鉴于此,本学位论文研究根据桔小实蝇转录组筛选得到的4个章鱼胺受体基因,选取在其他昆虫中研究较为深入同时功能较为重要的2个β-adrenergic-like章鱼胺受体基因BdOctβ1R和BdOctβ2R,通过分析其分子生物学特性、药理学性质以及生理功能,评估作为新型药剂靶标的潜力,为桔小实蝇新型控制剂的开发提供新思路。主要研究结果如下:1.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的cDNA克隆及序列分析通过分析和筛选桔小实蝇转录组数据库,结合RT-PCR克隆技术,成功获得了桔小实蝇章鱼胺受体基因BdOctβ1R和Bd Octβ2R的cDNA全长序列。利用TMHMM软件,预测推导的2个氨基酸序列的结构特征,发现这2个基因编码的蛋白序列都具有7跨膜结构,属于典型的G蛋白偶联受体。与已报道的模式昆虫果蝇、赤拟谷盗以及家蚕的β-adrenergic-like受体进行多序列比对,发现这2个基因序列具有相似的保守区域,同时表现出较高的同源性;通过与其他昆虫的章鱼胺受体的氨基酸序列进行系统发育分析,结果显示BdOctβ1R和BdOctβ2R与其他昆虫的β-adrenergic-like受体聚在一起,同源性较高,亲缘关系较近,因此,BdOctβ1R和BdOctβ2R属于β-adrenergic-like章鱼胺受体。2.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的表达模式解析利用RT-qPCR技术,解析桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R在不同发育阶段和不同组织中的表达模式。结果发现,BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇的各个发育阶段均有表达,其中在幼虫和成虫阶段具有较高的表达水平,从蛹期到成虫阶段,其表达量均为先降低后升高,并且分别在成虫的3日龄和7日龄达到最高。同时,检测这2个基因在桔小实蝇不同组织中的表达模式,发现BdOctβ1R和BdOctβ2R均在中枢神经系统(CNS)显著高表达,表明octopamine与中枢神经系统表达的BdOctβ1R和BdOctβ2R结合而发挥神经递质或神经调节的作用。饥饿胁迫能够显著诱导BdOctβ1R和BdOctβ2R的表达上调,尤其是BdOctβ1R的表达量发生显著上调,暗示BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇应对饥饿条件的生理活动中具有重要的调节作用。而在极端温度胁迫下,BdOctβ1R和BdOctβ2R的表达水平并未表现出明显的变化。3.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的生理功能分析基于BdOctβ1R和BdOctβ2R在饥饿和不同温度处理后的表达模式,进一步利用RNAi技术探究Bd Octβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇应对饥饿胁迫以及繁殖等生命活动中的重要功能。结果表明,在对BdOctβ1R的沉默效率达到70%的情况下,RNAi后的桔小实蝇在饥饿处理中死亡率较对照虽有所升高,但并无显著差异,说明BdOctβ1R虽然参与调节桔小实蝇应对饥饿胁迫,但其并未直接起到调节作用。而对BdOctβ2R的RNAi效果不明显,注射dsRNA后基因沉默效率仅为27%,也未对桔小实蝇交配率和产卵量造成显著影响。4.桔小实蝇BdOctβ1R和Bd Octβ2R基因的真核表达及其药理学特性分析以pcDNA3.1质粒为重组载体,章鱼胺受体的模式配体octopamine能够有效地激活BdOctβ1R和BdOctβ2R,并且其激活能力呈浓度依赖性,EC50值分别是9.11×10–10和1.29×10–9 M,说明BdOctβ1R和BdOctβ2R均在HEK细胞中实现了功能性表达。进一步测定5种激动剂(octopamine、tyramine、naphazoline、dopamine和phentolamine)和3种拮抗剂(mianserin、phentolamine和chlorpromazine)对BdOctβ1R和Bd Octβ2R的活力。激动剂活性测定中,naphazoline是BdOctβ1R和BdOctβ2R特异性最强、效果最好的激动剂,tyramine展现了一定的激动效应,而dopamine对BdOctβ1R和BdOctβ2R的激动效应极弱。拮抗剂活性测定中,phento

关键词：桔小实蝇章鱼胺受体饥饿胁迫极端温度真核表达药理学激动剂拮抗剂 RNAi

日本血吸虫神经递质章鱼胺受体（SjOAR）和延伸因子（SjEF）的鉴定及特性研究

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日本血吸虫神经递质章鱼胺受体（SjOAR）和延伸因子（SjEF）的鉴...

作者：孟培培河南科技大学

学位级别：硕士

日本血吸虫病（schistosomiasis）在我国南方是一种广泛分布和严重危害人民身体健康的人畜共患寄生虫病。目前主要的防制措施是控制传染源，其中以吡喹酮治疗带虫宿主是重要的环节。但实践表明化疗不能根除血吸虫病，包括吡喹酮，亦不... 详细信息

日本血吸虫病（schistosomiasis）在我国南方是一种广泛分布和严重危害人民身体健康的人畜共患寄生虫病。目前主要的防制措施是控制传染源，其中以吡喹酮治疗带虫宿主是重要的环节。但实践表明化疗不能根除血吸虫病，包括吡喹酮，亦不能防止血吸虫病的再感染，特别是反复感染后长期用药，可能会引起产生耐药性的危险，因此加强对新抗虫药物及疫苗的研究开发是当前血吸虫病防控研究的重要方向。本文根据实验室前期蛋白质组研究的结果，选择日本血吸虫章鱼胺受体（octopamine recptor,OAR）和蛋白质合成延伸因子（elongation factors,EF）基因，分析了其在日本血吸虫中的特性，在大肠杆菌中表达了重组蛋白并纯化得到了具有较高抗原性的融合蛋白，在小鼠日本血吸虫病模型中评估了其的保护效果，研究了免疫保护机制。并利用抑制药物观察了章鱼胺受体在血吸虫生长发育中的作用。1.日本血吸虫神经受体OAR的特性研究利用PCR克隆了日本血吸虫OAR的cDNA，序列分析显示SjOAR共1422bp，编码474个氨基酸。应用实时定量PCR分析日本血吸虫7、14、21、28d童虫和35、42d成虫及42d雌虫和雄虫的SjOAR转录情况，结果显示章鱼胺受体基因在日本血吸虫各期童虫和成虫中转录差异不大，28d童虫表达量较高，雌虫表达量比雄虫高。根据抗原性和保守性分析结果，选择其中一段261bp的序列，成功地构建了重组表达质粒SjOAR-pET-32a，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达并纯化到重组蛋白，分子量为32kD，Western blotting分析表明该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。应用SjOAR-pET-32a重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体进行免疫组化和免疫荧光技术对该蛋白的表达部位进行分析，结果显示章鱼胺受体在日本血吸虫体内表达量比较低，在日本血吸虫紧邻表膜附近以及生殖系统中分布较多，其它组织部分分布较少。用纯化的SjOAR-pET-32a重组蛋白免疫BALB/c小鼠进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验，结果与空白对照组相比，重组蛋白SjOAR-pET-32a诱导了28.12%的减虫率和38.20%的肝脏减卵率，差异极显著（p章鱼胺受体抑制药物进行的小鼠体内试验结果表明，与PBS对照组相比，尾静脉注射cis(Z)-flupenxio组获得了30.90%的减虫率，47.31%的肝脏减卵率，差异极显著（P﹤0.01）;25dcis(Z)-flupenxio组获得了15.49%的减虫率，49.95%的肝脏减卵率，差异极显著（P﹤0.01）;Mianserin组获得了20.27%的减虫率，28.87%的肝脏减卵率，差异不显著（P﹥0.05）。结果表明日本血吸虫章鱼胺受体有作为抗血吸虫药物研究靶标的潜力。2.日本血吸虫EF的克隆表达及免疫保护的初步评估应用PCR克隆了日本血吸虫延伸因子的基因片段，大小为642bp，包含整个ORF。通过序列比对和结构域分析，推测该基因可能为EF-β型基因。成功地构建了含SjEF的重组表达质粒SjEF-pET-28a，对重组蛋白进行纯化并制备了多克隆抗体。Western blotting分析表明该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。免疫组化分析显示SjEF主要分布在日本血吸虫表膜和实质部分，在肌肉组织中分布均匀。用该重组蛋白免疫小鼠后，可诱导小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。进一步测定三次免疫后抗SjEF特异性的IgG1、IgG2a抗体水平，并计算IgG1/IgG2a比值，结果表明SjEF诱导产生的抗体亚型趋向于Th2型。免疫组小鼠血清中IL-2、IL-10、IL-12的含量比206佐剂组有所升高，但IL-4、INF-γ的水平差异不大。研究结果初步明确了SjEF基因的特性，也为后续研究提供了基础。

关键词：日本血吸虫章鱼胺受体延伸因子 DNA疫苗药物抑制