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ENU对草鱼精子的诱变及在F1代中的突变效率

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ENU对草鱼精子的诱变及在F1代中的突变效率

适用于大豆的CRISPR/Cas9体系的构建

2011年中国水产学会学术年会

作者：邹曙明蒋霞云孙成飞郭秀明程洛单上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点开放实验室

ENU诱变是近年来发展起来的获得模式生物功能突变体的新手段,在养殖鱼类的遗传改良方面也具有潜在的发展前景。研究显示,以0-10mM等不同浓度的ENU溶液处理草鱼精子45 min,与野生型雌鱼受精产生的胚胎在体节期的畸形率分别为3.1-91.3%,... 详细信息

ENU诱变是近年来发展起来的获得模式生物功能突变体的新手段,在养殖鱼类的遗传改良方面也具有潜在的发展前景。研究显示,以0-10mM等不同浓度的ENU溶液处理草鱼精子45 min,与野生型雌鱼受精产生的胚胎在体节期的畸形率分别为3.1-91.3%,胚胎畸形率与ENU浓度成正比;正常鱼苗的出苗率分别为93.1-4.4%,与ENU浓度成反比。选用1mM浓度ENU溶液处理精子,受精后产生的子代的正常率大约为50%,这些子代在1龄阶段生长差异极大,产生了一定比例发育正常、快速生长的个体;提取15尾l龄诱变F1子代的基因组DNA,对6个生长发育通路相关基因igf-2a、igf-2b、mstn-1、mstn-2、fst-1和fst-2的部分阅读框进行基因组DNA的PCR扩增、克隆和测序,结果显示,ENU主要诱变基因组DNA产生GC到AT或AT到GC的点突变,可造成密码子的无义突变、错义突变和同义突变,ENU对上述6个基因的平均诱变率为0.41%。这些结果表明,ENU溶液浸泡精子可在草鱼中实现高效诱变,在养殖鱼类诱变育种领域具有潜在的应用前景。己发表在今年的PLoS ONE 6(10):e26475。

关键词：草鱼 ENU诱变诱变F1代突变效率

来源： cnki会议评论

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分子植物育种 2024年第19期 6359-6367页

作者：吴楠姜龙于晓明宁夕琳杨祥波元明浩吉林农业科技学院农学院

为了验证不同靶点的突变效率以及鉴定突变类型，本试验在基因GmFAD2-1 (g3)、GmFAD2-2b(g6)的第一个外显子和第二个外显子处分别设计两对靶点，通过体外活性检测，目的是验证各个靶点的活性，并分别构建不同靶点的基因编辑载体，利用发... 详细信息

为了验证不同靶点的突变效率以及鉴定突变类型，本试验在基因GmFAD2-1 (g3)、GmFAD2-2b(g6)的第一个外显子和第二个外显子处分别设计两对靶点，通过体外活性检测，目的是验证各个靶点的活性，并分别构建不同靶点的基因编辑载体，利用发根农杆菌转化法进一步验证其突变的效率及类型。结果表明：设计在基因第一个外显子区域的靶点，活性明显高于其他位置处设计的靶点；设计的靶点中GC的含量分别为52.6%、36.8%、31.5%、21.1%，说明GC含量越高，靶点的活性越强；通过发根农杆菌介导法快速验证不同靶点的突变效率，以U6为启动子的g3-Target1突变效率为92%，突变类型主要是碱基的插入、缺失、替换；g3-Target2突变效率为36%，突变类型主要是碱基的插入、缺失。以U6为启动子的g6-Target1突变效率为84%，突变类型主要是碱基的插入、缺失、替换；g6-Target2突变效率为8%，突变类型主要是突变类型主要是碱基的插入、缺失。

关键词：大豆 CRISPR/Cas9 突变效率发根农杆菌

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两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较

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遗传 2016年第2期38卷 144-154,181-184页

作者：张峰华王厚鹏黄思雨熊凤朱作言孙永华中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072

为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9 c DNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。本文选取两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(z Cas9_bz和z Cas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp... 详细信息

为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9 c DNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。本文选取两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(z Cas9_bz和z Cas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp及内源chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a)分别进行敲除,通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析比较了两种Cas9的敲除效率。结果发现,z Cas9_wc在各种情况下都显现出较高的敲除效率,而z Cas9_bz的效率相对较低。

关键词： CRISPR/Cas9 斑马鱼基因敲除突变效率

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CRISPR/Cas9与ZFNs 介导牛MSTN位点基因打靶效率的比较研究

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CRISPR/Cas9与ZFNs 介导牛MSTN位点基因打靶效率的比较研究

作者：刘慧内蒙古大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的由sgRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因位点并进行编辑的技术,能够在复杂的基因组和RNA水平引入精细的改变或沉默,相较于之前的锌指核酸酶技术(Zinc finger nuclease, ZFN)和转录激活子类似的效应子核酸... 详细信息

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的由sgRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因位点并进行编辑的技术,能够在复杂的基因组和RNA水平引入精细的改变或沉默,相较于之前的锌指核酸酶技术(Zinc finger nuclease, ZFN)和转录激活子类似的效应子核酸酶技术(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN),CRISPR/Cas9的设计和使用更加方便快捷,并且不需要对序列特殊地分析,也不需要对应地去寻找识别模块,其具有极大的应用优势。本研究针对牛肌肉抑制素基因(myostatin, MSTN)第二外显子的一段序列设计构建了CRISPR/Cas9A打靶载体,针对MSTN的第二外显子的另一段序列同时设计并构建了一组ZFNs和一个CRISPR/Cas9B打靶载体,然后使用电转染方法分别将ZFNs载体和Cas9载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,通过口吸管挑取单细胞并扩培,利用PCR和测序检测突变体的产生。结果显示,ZFNs转染所获得的74株细胞克隆中含有4株基因突变细胞系,敲除效率为5.12%;CRISPR/Cas9A转染的17株单克隆细胞中含有1株敲除细胞系,且为缺失8bp的双等位基因敲除细胞系,敲除效率为5.88%;CRISPR/Cas9B转染的77株单细胞克隆中有21个突变细胞系,敲除效率为27.05%,其中包括2株双等位基因敲除细胞系,分别为3bp插入突变和13bp缺失突变,双等位基因的敲除效率为9.52%。以上结果表明,针对第二外显子的打靶载体CRISPR/Cas9B的打靶效率高于CRISPR/Cas9A打靶载体,而针对同一位点的CRISPR/Cas9B的敲除效率约是ZFNs的敲除效率的5倍。进而为了检测ZFNs和CRISPR/Cas9B的外源整合效率,针对ZFNs和CRISPR/Cas9B靶向位点构建表达hfat-1和EGFP基因的质粒pflrkt和pGlrkt,在外源基因的5’端和3’端分别带有与靶向位点序列相同的885bp和823bp的同源臂。通过电转染的方法将ZFNs:pflrkt/pGlrkt和CRISPR/Cas9B:pflrkt/pGlrkt分别导入到牛胎儿成纤维细胞中,经过G418筛选、细胞单克隆制备和同源臂跨臂PCR检测,最终获得外源基因定点整合的细胞系。经过鉴定,在95株ZFNs介导的pGlrkt定点整合的细胞系中共获得13株打靶细胞,打靶效率为13.68%,未获得pflrkt定点整合细胞系;使用CRISPR/Cas9B介导的pflrkt载体定点整合的81株细胞系中获得64株打靶细胞,pGlrkt载体定点整合的119株细胞系中获得74株打靶细胞,其打靶效率分别为79.01%和57.84%。实验证明,CRISPR/Cas9介导的基因打靶效率明显高于ZFNs,约为ZFNs的5倍。本研究最终共获得26株MSTN敲除的牛胎儿成纤维细胞系和64株hfat-1定点整合细胞系,这些细胞为后续的体细胞核移植和胚胎移植提供了可选的供体细胞。同时实验证明,在牛上,CRISPR/Cas9系统介导的基因打靶效率要明显高于ZFNs。

关键词： CRISPR/Cas9 ZFN MSTN 突变效率基因打靶

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除Myostatin基因牛胎儿成纤维细胞株

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黑龙江畜牧兽医 2015年第9期 50-53页

作者：杨宇张伟伟胡倩佟慧丽严云勤东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验... 详细信息

CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子序列随机设计靶位点,利用T7核酸内切酶I(T7EI)从中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体,在无筛选标记条件下对牛胎儿成纤维细胞进行基因敲除。结果表明:经过长时间培养获得了基因敲除的细胞株。说明CRISPR/Cas9技术用于基因敲除方面的研究应用前景广阔。

关键词： CRISPR/Cas9 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) 转染敲除突变效率细胞株

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CRISPR/Cas9技术在制备牛Myostatin基因敲除细胞株上的应用

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CRISPR/Cas9技术在制备牛Myostatin基因敲除细胞株上的应用

作者：杨宇东北农业大学

学位级别：硕士

近年来,基因编辑技术已经得到了迅速的发展。与传统的基因克隆技术不同,通过基因编辑技术,人们可以对基因进行敲除、插入、定点突变等修饰操作,从而实现基因功能与调控元件的研究。基因编辑技术在基因制药、基因诊断、基因治疗等技术方... 详细信息

近年来,基因编辑技术已经得到了迅速的发展。与传统的基因克隆技术不同,通过基因编辑技术,人们可以对基因进行敲除、插入、定点突变等修饰操作,从而实现基因功能与调控元件的研究。基因编辑技术在基因制药、基因诊断、基因治疗等技术方面已经取得的巨大的成果,将极大地改变人类生命和生活的面貌。CRISPR/Cas9技术(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)作为第三代人工核酸内切酶技术,是一种具有广阔前景的基因修饰工具。在细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制的CRISPR/Cas系统,可用来对抗病毒及外源DNA的入侵。其衍生的CRISPR/Cas9技术相对于之前的锌指核酸内切酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,Talens)技术来说,该技术具有成本低、毒性小、适用范围广、操作周期短等优点,为基因组定向改造、调控与应用等带来突破性革命。目前,CRISPR/Cas9技术已经在许多模式动物基因敲除方面的研究上获得成功案例,其方法大部分都是利用注射直接获得模式动物或者利用筛选标记基因来获得目的细胞,但是采用CRISPR/Cas9技术敲除牛基因获得不含有筛选标记的细胞实验还很少。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8,属于TGF-β超家族,能够通过调控成肌细胞的大小、数量和增殖速度来实现负向调控节肌肉的生长。哺乳动物MSTN基因缺失或失活会出现肌纤维直径变大或肌纤维数增加,导致肌肉过度发育的现象。自然诱变或者基因编辑都可以使MSTN基因反生功能性障碍,使动物出现“双肌”的性状。MSTN基因的研究对动物产肉量具有很大的意义,已经得到了广泛的研究。所以,通过基因编辑技术来获得“双肌”性状的肉牛具有很重要的生产价值和广阔的应用价值。本研究利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子区域序列随机设计靶位点。靶位点活性的好坏,没有采用传统的SSA活性检测法,而是在无筛选标记条件下利用T7核酸内切酶I(T7EI)从设计的靶位点和载体中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体。之后对鲁西黄牛(LXHN)胎儿成纤维细胞进行基因敲除实验,通过有限稀释法制备单细胞克隆,利用PCR测序和T7EI的方法来鉴定细胞克隆,获得MSTN基因敲除的细胞株,为转基因动物的制备提供材料。同时简单检测了在敲除试验中双靶点对突变效率的影响。主要研究结果如下:***/Cas9打靶载体的构建以牛MSTN基因第二外显子为靶位点的ps Pg RNA-M-A、p X330-M-A;以MSTN基因第三外显子为靶位点的ps Pg RNA-M-B、p X330-M-B、ps Pg RNA-M-X、ps Pg RNA-M-Y。***/Cas9打靶载体突变效率的检测采用T7EI酶切法检测不同靶位点的突变效率,最高突变效率为36.67%3.有限稀释法制备单细胞克隆和MSTN基因突变细胞株的筛选。采用有限稀释法共获得的53个细胞克隆。其中5个MSTN基因敲除克隆(MSTN-/-)。4.双靶点法突变效率检测试验第三外显子3个靶位点两两组合的突变效率的高低,证明双靶点突变效率与靶点间的距离有关。

关键词： CRISPR/Cas9 MSTN基因基因敲除突变效率细胞克隆细胞株

用合成的寡脱氧核苷酸作为专一位点诱变剂构建突变型

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中国生物工程杂志 1983年第2期 15-18页

作者： M. Smith ,S. Gillam ,还连栋

本文描述产生和分离即使在表型上是沉默的一些特定点突变的一种方法。这种方法是用一个合成的寡脱氧核苷酸(它在给定的位置上与野生型是不同的)作为特定的诱变剂,并在体外把它整合到基因组DNA中。乍看起来,这种方法比其它方法更费劲,因... 详细信息

本文描述产生和分离即使在表型上是沉默的一些特定点突变的一种方法。这种方法是用一个合成的寡脱氧核苷酸(它在给定的位置上与野生型是不同的)作为特定的诱变剂,并在体外把它整合到基因组DNA中。乍看起来,这种方法比其它方法更费劲,因为它需要一个合成的寡脱氧核苷酸。但是,有一种较新的合成方法缩短了取得寡脱氧核

关键词：诱变剂大肠杆菌大肠埃希氏菌埃希氏杆菌属 DNA 引物多聚酶聚合酶核昔酸突变型突变体突变效率颠换位点

利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

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利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究