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芹菜夜蛾核型多角体病毒的空斑纯化及克隆株的生物测定

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中国生物防治 2004年第3期20卷 178-181页

作者：徐莉彭建新洪华珠华中师范大学昆虫学研究所武汉430079

利用空斑技术从芹菜夜蛾核型多角体病毒分离筛选了一毒力较强的SfaMNPV D克隆株。SfaMNPV D克隆株感染 5B1细胞 ,72h胞外病毒达最大滴度 ,组织培养半感染剂量为 3 .89×1 0 8TCID50 /ml,多角体产量达 4.0× 1 0 7PIBs/ml;生物测定结果表... 详细信息

利用空斑技术从芹菜夜蛾核型多角体病毒分离筛选了一毒力较强的SfaMNPV D克隆株。SfaMNPV D克隆株感染 5B1细胞 ,72h胞外病毒达最大滴度 ,组织培养半感染剂量为 3 .89×1 0 8TCID50 /ml,多角体产量达 4.0× 1 0 7PIBs/ml;生物测定结果表明 ,SfaMNPV D克隆株感染 3龄棉铃虫幼虫的LC50 为 7.1 4× 1 0 5PIBs/ml,原毒株的LC50 为 4.81× 1 0 6PIBs/ml。SfaMNPV D病毒DNA经几种限制性内切酶消化 ,各片段积加测得基因组DNA分子量为 1 1 3 .78kb .

关键词：芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株空斑纯化生物测定

用作疫苗的减毒活RSV空斑纯化株的免疫学特性

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国际生物制品学杂志 1999年第4期22卷 182-183页

作者：黄升海

作者将2个A亚型呼吸道合胞病毒（RSV）临床分离株在人胚肺二倍体细胞（MRC-5细胞）中分别经25℃传38代、35℃传10代、30℃传10代制成冷适应株CRIa

关键词： RSV 减毒脾细胞空斑纯化病毒滴度

家蚕核型多角体病毒广东株bro基因家族分析

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病毒学报 2007年第6期23卷 485-489页

作者：庞敏潘国庆李田王霞周泽扬西南大学农业部蚕学重点实验室重庆400715

对BmNPV广东株进行了空斑纯化,并对该基因组的bro基因家族进行克隆,获得4个bro基因序列(bro-a、bc、、d),与GenBank数据库中BmNPVbro基因序列及本实验室测定的重庆株的bro基因序列进行比较分析,结果表明广东株BmNPVbro基因存在插入及缺... 详细信息

对BmNPV广东株进行了空斑纯化,并对该基因组的bro基因家族进行克隆,获得4个bro基因序列(bro-a、bc、、d),与GenBank数据库中BmNPVbro基因序列及本实验室测定的重庆株的bro基因序列进行比较分析,结果表明广东株BmNPVbro基因存在插入及缺失,其氨基酸的改变主要发生在对应蛋白的N端部分;同时进行的bro基因的系统发生分析表明,广东株bro基因分别位于3个亚组中,广东株bro-d与日本T3、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A,广东株bro-a、c与T3、CQ1株bro-a、c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B,广东株bro-b与T3、CQ1株bro-b、e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C,bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征,进一步支持了Kang等的观点:bro-d是BmNPV生存所必需的,bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测:SC7株的3个bro基因可能是BmNPVbro家族出现的最简约形式。

关键词： BmNPV bro基因空斑纯化插入缺失系统发育

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重组昆虫杆状病毒构建和筛选技术进展

昆虫学报 2004年第6期47卷 837-843页

作者：曹翠平吴小锋浙江大学动物科学学院生物资源与基因工程研究室杭州310029

昆虫杆状病毒作为高效的真核表达载体 ,现已广泛应用于各种外源目的基因的表达。但由于重组病毒产生的比例很低(通常只有 0 1 %～ 1 % ) ,成为制约该系统应用的技术瓶颈。本文概括了近年来发展的重组病毒的构建和筛选方法。

关键词：重组昆虫杆状病毒空斑纯化线性化技术 Bac-to-Bac

中国登革Ⅲ型和Ⅳ型病毒分离株及登革Ⅳ型病毒减毒株特性研究

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中国登革Ⅲ型和Ⅳ型病毒分离株及登革Ⅳ型病毒减毒株特性研究

作者：陈柠中国食品药品检定研究院

学位级别：硕士

Ban18株于1981年分离于我国西双版纳地区，将Ban18株和国际标准株H241株分别在Vero细胞和乳鼠脑内传代，用空斑法在Vero细胞单层上进行病毒滴度测定，结果表明两株病毒均对Vero细胞有致细胞病变作用，可以形成肉眼可见的空斑，病毒滴度... 详细信息

Ban18株于1981年分离于我国西双版纳地区，将Ban18株和国际标准株H241株分别在Vero细胞和乳鼠脑内传代，用空斑法在Vero细胞单层上进行病毒滴度测定，结果表明两株病毒均对Vero细胞有致细胞病变作用，可以形成肉眼可见的空斑，病毒滴度分别为2.0×105PFU/mL和5.1×107PFU/mL。根据GenBank上已经提交的其它登革4型病毒全基因组序列，设计扩增Ban18株和H241株全基因组的引物，测定两株病毒的基因组序列，并进行比对。测序结果表明，两株病毒全长均为10664nt，含一个开放阅读框，编码3387个氨基酸，两株病毒核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.7%和99.4%，全基因组中共有6个核苷酸差异位点和3个氨基酸差异位点。采用E基因区段序列对两株病毒进行基因分型，两株病毒均为基因Ⅰ型。将登革4型病毒Ban18株及其在原代地鼠肾细胞上传代的减毒株（Ban18HK20和Ban18HK30株）在Vero细胞传代后进行生物学特征和基因序列特征的研究。结果表明，三株病毒均能被登革4型特异性腹水有效中和，中和指数>1000，提示三株病毒均为登革4型病毒。Ban18HK20株和Ban18HK30株在Vero细胞上形成的空斑形态较其母株大且模糊。二者对9～11g小鼠的脑内lg(PFU/LD50）均>4.5，而Ban18株的lg(PFU/LD50)为0.4，且二者对2～4日龄乳鼠的致病力也明显低于其母株Ban18株，说明表明Ban18株在传代过程中毒力逐渐减弱。将三株病毒稀释到106PFU/mL后免疫小鼠，两周后用国际标准株H241株进行脑内攻击，结果表明Ban18株和Ban18HK20株对H241脑内攻击的保护指数约为100，而Ban18HK30株对H241的脑内攻击基本没有保护作用，说明前二者的免疫原性较好。同时，为了获得毒力更低的毒株，本实验将两株减毒株Ban18HK20株和Ban18HK30株进行空斑纯化，分别挑选9个和5个空斑克隆进行空斑形态和5～6日龄乳鼠脑内毒力的比较，结果表明从Ban18HK20株挑选的9个克隆株中的3个毒株对乳鼠脑内毒力低于Ban18HK20原株，Ban18HK30株的5个克隆株则无明显差别。比较Ban18株及其减毒株的全基因组序列，结果表明Ban18株和Ban18HK20株有8处核苷酸差异，其中3处引起氨基酸变化，即C111位、E155位、E369位和3’UTR219位，这几位变化可能与病毒毒力密切相关，特别是E155和3’UTR216，E155位会影响E蛋白的糖基化，3’UTR216位会改变3’UTR的二级结构。桂登-1株（GD-1株）和桂登-11株（GD-11株）分离自1980年广西合浦县的登革热流行中，均为登革3型病毒。本研究将两株病毒在NIH乳鼠脑内传代两次后，病毒滴度达到3×103PFU/mL，同时将国际登革3型标准株标准株H87在乳鼠脑内传代一次，病毒滴度为2.6×105PFU/mL。前二者在Vero细胞单层上形成的空斑形态与H87株有明显差异。测定上述三株病毒的全基因组序列并进行分析，两株病毒全长均为10707nt，与H87株核苷酸同源性为96.0%，氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异，二者和H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测，二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析，结果表明二者均属于亚型Ⅱ，与分离自泰国的两株毒株进化关系最近。

关键词：登革4型病毒毒力序列分析基因型登革4型病毒减毒株毒力免疫原性空斑纯化毒力位点登革3型病毒二级结构亚型进化树

江苏省猪流行性腹泻病毒G2b亚型变异株的流行状况调查和致弱毒株的研制

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江苏省猪流行性腹泻病毒G2b亚型变异株的流行状况调查和致弱毒株...

作者：赵峰扬州大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道疾病。自1984年起,PEDV G1a亚型一直是引起我国仔猪腹泻的重要病原,给养猪业造成了巨大的经... 详细信息

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道疾病。自1984年起,PEDV G1a亚型一直是引起我国仔猪腹泻的重要病原,给养猪业造成了巨大的经济损失。2010年开始,我国南方多个省份暴发了由PEDVG2b亚型变异毒株引起的仔猪腹泻,并迅速蔓延至全国。与经典的G1a亚型毒株相比,新出现的G2b亚型毒株致病性更强。由于G1a亚型疫苗株CV777不能针对G2b亚型变异毒株提供有效的保护,因此迫切需要研制G2b亚型变异毒株疫苗。本研究调查了 2015～2017年间江苏省部分规模化猪场PEDV G2b亚型变异株的流行状况,并对本实验室分离鉴定的1株G2b亚型变异株进行传代致弱,为进一步研制弱毒疫苗奠定了基础。1、江苏省2015～2017年PEDV G2b亚型变异株的流行状况调查2015～2017年间,从江苏省发生仔猪腹泻的规模化猪场收集临床病料176份,通过实时荧光定量PCR方法从中检测出19份PEDV阳性。对这19份阳性病料中的PEDV进行分离鉴定,成功分离到1株G2b亚型毒株(命名为PED-JS-2016-05-4)。以PCR从19份PEDV阳性病料中扩增PEDV的纤突蛋白(S)基因,测序和遗传进化分析,发现其中17份为G2b亚型变异株,另外2份为G1b亚型毒株。检测到的G2b亚型变异株与国内外报道的G2b亚型变异株的S基因核苷酸同源性高达98.5～99.7%;与G1a亚型疫苗株CV777及其他毒株亲缘关系比较远,S基因核苷酸同源性为93.6～94.3%。检测到的2个G1b亚型毒株与在美国最早发现的该亚型代表毒株OH851的S基因核苷酸同源性高达99.5%;与G1a亚型毒株S基因核苷酸同源性只有95.6～96.8%。研究表明,当前江苏省主要流行的PEDV毒株为G2b亚型变异株。本研究检测到的G2b亚型变异株与CV777疫苗毒株在S蛋白中和表位区存在较多的氨基酸差异,并且主要集中在COE中和表位区,在SS6中和表位区只存在1个突变,SS2和2C10中和表位区没有突变。此外,通过CBS在线软件包进行S蛋白潜在糖基化位点预测发现,与CV777疫苗毒株相比,17株G2b亚型变异株具有6个相同的潜在糖基化位点突变,其中3个位点氨基酸突变(N57V,N127I,T232I)导致对应部位的潜在糖基化位点缺失,而另外3个氨基酸位点突变(S59N,I116T,T1193N)产生了新的潜在糖基化位点。与CV777相比,2株G1b亚型毒株只有1个潜在糖基化位点存在差异,即1193位氨基酸由T突变为N产生了一个新的潜在糖基化位点。2、PEDV G2b亚型变异株JSX2014的致弱研究选取实验室前期分离鉴定的PEDV G2b亚型变异株JSX2014进行致弱研究,以期培育弱毒疫苗株。JSX2014毒株在Vero细胞连续传代后产生的典型CPE为:细胞肿胀、变圆,细胞单层形成网眼状并逐渐崩解脱落。JSX2014毒株在细胞上可以形成大小不同的空斑,推测与不同代次病毒的复制能力有关。为了筛选到复制能力较好的毒株,在传代过程中分别挑取形态大小差异明显的空斑,进行空斑纯化,通过测定TCID50来评价不同空斑克隆株的复制能力。结果表明,大空斑克隆株复制能力显著优于小空斑克隆株。因此,多次挑取大空斑进行克隆化,连续传代至130代,获得的毒株命名为JSX2014/ATT。选取未吸吮母乳的3日龄初生仔猪对JSX2014/ATT进行致病性试验,每只仔猪肌肉注射2 ×107TCID50的病毒。每天观察是否有呕吐和腹泻等临床症状,并采集肛拭子以及血液进行PEDV检测。5 d后处死仔猪,对肠管进行组织病理学检查。结果显示,感染仔猪未出现腹泻相关的临床症状;仅在第1 d血液中检测到PEDV,肛拭子中不能检测到PEDV;仔猪肠组织结构完整,肠绒毛未发生萎缩、脱落,表明JSX2014/ATT株已经致弱。对JSX2014/ATT株的全基因组进行测序,并且与原始的JSX2014株作了比较。两者在S基因上共有11个核昔酸发生突变,E和N基因都只有一个核苷酸发生突变,M基因除了 2个核苷酸的突变外还有1个15 nt的插入。非结构基因的突变主要集中在ORF1ab上,共有13个核苷酸发生突变,ORF3在第14位核苷酸插入一个T而导致翻译提前终止。综上所述,江苏省近期的PEDV流行毒株为G2b亚型变异株,同时也存在少量G1b亚型毒株。通过Vero细胞连续传代结合病毒空斑纯化技术,成功致弱了一株PEDV G2b亚型变异株,为进一步研制弱毒活疫苗奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒流行病学 G2b亚型空斑纯化致弱研究

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人3、7型腺病毒灭活疫苗的前期研究

人3、7型腺病毒灭活疫苗的前期研究

作者：张玲广州医科大学

学位级别：硕士

【目的】筛选疫苗生产用人3、7型腺病毒培养的细胞基质,分离、培养人3、7型腺病毒疫苗候选株,并进行空斑纯化。【方法】1、细胞基质的初步筛选:将已有的人3、7型腺病毒株分别感染5种细胞系:HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38,观察细胞... 详细信息

【目的】筛选疫苗生产用人3、7型腺病毒培养的细胞基质,分离、培养人3、7型腺病毒疫苗候选株,并进行空斑纯化。【方法】1、细胞基质的初步筛选:将已有的人3、7型腺病毒株分别感染5种细胞系:HEK293、AD293、Vero、MRC-5、WI-38,观察细胞病变情况和感染滴度,筛选出易感细胞系。并运用初步筛选出的易感细胞系AD293和MRC-5细胞分别培养、氯化铯密度梯度离心纯化携带GFP(Green Fluorescent Protein)基因的重组3型腺病毒感染A549细胞,观察细胞病变情况。从而筛选出一种培养3、7型腺病毒的疫苗生产用细胞基质。2、人3、7型腺病毒毒株分离及免疫:通过MRC-5细胞分离培养153份咽拭子样品(广州;北京)。PCR扩增腺病毒的六邻体蛋白基因、纤突蛋白基因、五邻体基座蛋白基因并测序进行型别鉴定。腺病毒分离株在MRC-5细胞中连续5次传代后,进行病毒感染滴度测定,筛选出感染滴度≥4.0 lg CCID/mL的腺病毒株。初步筛选病毒株在MRC-5细胞培养后经3次反复冻融,离心取上清,病毒上清按1:4000的比例加入β-丙内酯灭活,4℃放置24小时,再37℃放置2小时,最后腹腔注射小鼠,免疫剂量500ul/只。对照组腹腔注射PBS。免疫21天和44天后,获取血清,灭活后进行细胞中和实验。3、空斑纯化:分别采用Vero、A549、MRC-5细胞对腺病毒分离株(其抗体效价>1:8)进行空斑纯化。纯化后腺病毒株采用三个主要蛋白基因的PCR扩增及测序及血清鉴别试验进行型别验证。再使用3种细胞系(A549、HEK293、MRC-5细胞)进行病毒感染滴度的测定。4、腺病毒培养条件初步建立:人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株分别使用病毒接种量为0.006MOI、0.012MOI、0.018MOI,培养基含血清浓度为2%、5%、10%,分别在35℃、37℃,含5%CO2培养箱培养,观察感染后12、24、36、48、60、72、84、96、108小时在MRC-5细胞病变的情况和感染滴度。【结果】1、5种细胞系中,人3型腺病毒在HEK293细胞最敏感,其次为MRC-5和AD293细胞,不敏感细胞为Vero和WI-38细胞;人7型腺病毒在HEK293和MRC-5细胞最敏感,其次为AD293细胞,不敏感细胞为Vero和WI-38细胞。重组3型腺病毒Ad3EGFP在相同培养条件下,MRC-5细胞培养获得总的病毒粒子为3.0×10而AD293细胞获得总的病毒粒子为2.04×10。但由MRC-5细胞获得的Ad3EGFP病毒感染A549细胞48小时后,接种1×10个病毒粒子可见细胞发出绿色荧光,而AD293细胞获得的病毒未见荧光。2、从153份咽拭子中分离得到31株腺病毒,其中21株为人3型腺病毒,10株为人7型腺病毒。筛选出11株病毒滴度≧4.0 lg CCID/mL的病毒株,其中6株为人3型腺病毒,5株为人7型腺病毒。11株腺病毒经β-丙内酯灭活后分别进行免疫原性检测,11株病毒株的初次免疫中和效价均>1:8,免疫阳转率达到100%。初次免疫后,3型腺病毒株BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302、BJ-70248共5株诱导的中和抗体效价无显著性差异。BJ-70327株诱导中和抗体效价均低于其他4株(BJ-35、BJ-50、BJ-57、BJ-70302)。7型腺病毒株诱导的中和抗体效价无显著性差异。二次免疫后不同3、7型腺病毒株诱导的中和抗体效价均无显著性差异,但二次免疫诱导的中和抗体效价均高于初次免疫。3、尝试采用Vero、A549、MRC-5细胞对11株腺病毒株进行空斑纯化,只有Vero细胞成功将腺病毒空斑纯化。纯化后病毒株进行3个主要蛋白基因的PCR扩增及测序、血清鉴别实验均证明腺病毒型别正确。分别使用A549、HEK293、MRC-5细胞系测定腺病毒感染滴度,11株腺病毒在MRC-5细胞和HEK293细胞的感染滴度一致,其中6株人3型腺病毒和3株人7型腺病毒的感染滴度均为5.0 lg CCID/ml,另2株人7型腺病毒感染滴度为lg 4.0 lg CCID/ml。在A549细胞测定感染滴度均比另2个细胞系高1个lg值。4、人3型腺病毒BJ-50株和人7型腺病毒BJ-70274株在含10%血清的MEM培养基培养时,接种病毒量分别为0.006、0.012、0.018 MOI,导致病变均较快,培养48-60个小时可收获病毒,但最终收获的病毒感染滴度均未见明显差异。在含2%和5%血清的培养基培养时,接种病毒量分别为0.006、0.012、0.018 MOI,病毒感染滴度均未见明显差异,但含5%血清培养病变比2%血清培养的病变快,可提前24个小时收毒。无论是35℃还是37℃含5%CO2培养箱培养均未

关键词：人3型腺病毒人7型腺病毒人二倍体细胞疫苗候选株空斑纯化

新城鸡瘟病毒Ⅱ系减毒株诱生干扰素能力的观察

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新疆医学院学报 1980年第3期 149-152页

作者：张延盛段淑贞新疆医学院微生物学教研室

1957年Issacs等发现干扰素以后,许多人证明干扰素及其类似物可由多种病毒及非病毒物质诱导产生;人外源性干扰素对防治病毒性疾病等有一定效果。存在的问题之一是如阿提高干扰素的产量。为此,我们用新城鸡瘟病毒三代空斑纯化株,对其诱生... 详细信息

1957年Issacs等发现干扰素以后,许多人证明干扰素及其类似物可由多种病毒及非病毒物质诱导产生;人外源性干扰素对防治病毒性疾病等有一定效果。存在的问题之一是如阿提高干扰素的产量。为此,我们用新城鸡瘟病毒三代空斑纯化株,对其诱生干扰素的能力和影响因素进行了观察。

关键词：干扰素滴度紫外线照射尿液 NDVI 抗病毒药效价空斑纯化减毒株病毒液

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昆虫核多角体病病毒——最近的研究

蚕学通讯 1986年第3期 34-36页

作者：河原烟勇万永继九州大学农学部生物防治研究室

昆虫核多角体病毒(nuclear Poly—hedrosis Viruses of insects)是具双链DNA的,典型的无脊稚动物病毒,属于杆状病毒科(Baculoviridae)亚组A群。核多角体病毒的隐码为D/2:80—100/8—15:UorUc/E;I/O。关于核多角体病毒(NPV)的研究六十年... 详细信息

关键词： NPV DNA 限制酶细胞系变异株核酸酶空斑纯化多角体昆虫重组型