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湖北农业科学 2010年第4期49卷 785-787页

作者：庞敏孙翰昌周泽扬重庆文理学院生命科学与技术学院重庆402168 重庆师范大学生命科学学院重庆400047

以家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWU1)为病毒培养载体,利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆,经扩大培养,获得了GD株空斑克隆株系。根据Bm NPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析,选出其中SNP位点较多的... 详细信息

以家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWU1)为病毒培养载体,利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆,经扩大培养,获得了GD株空斑克隆株系。根据Bm NPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析,选出其中SNP位点较多的gcn 2(General control nonderepressible 2)基因,用于验证BmNPVGD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPVGD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因,经pMD18-T克隆后测序;将两株病毒的gcn2基因分别进行SNP位点分析,发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个,而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后均未发现多态性位点,说明空斑克隆株经纯化后,病原基因组的纯粹性获得了提高,病原得到了纯化。

关键词：家蚕核型多角体病毒空斑克隆 SNP位点纯粹性

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家蚕核型多角体病毒广东分离株空斑克隆株系的建立及其bro基因家族的分析

家蚕核型多角体病毒广东分离株空斑克隆株系的建立及其bro基因家...

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作者：庞敏西南大学

学位级别：硕士

通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且大的差异主要位于bro（baculovirus repeated open reading frames）基因家族所在的区域。bro家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基... 详细信息

通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且大的差异主要位于bro（baculovirus repeated open reading frames）基因家族所在的区域。bro家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在碱基序列上也有明显不同。近年来，有关BmNPV bro基因的研究较多，学者们认为bro基因在病毒侵染宿主的过程中具有一定的功能。BmNPV T3株基因组中存在bro-a，bro-b，bro-c，bro-d，bro-e 5个拷贝，它们分布于基因组的三个区域。我们研究发现，BmNPV CQ1株在基因组的第二个区域缺失bro-b基因，GD株在基因组的第三个区域缺失bro-e基因。本研究以BmNPV GD株为研究材料，对其进行了空斑纯化，并对其bro基因家族进行了克隆分析，对bro基因的功能和进化进行了探讨。 *** GD分离株空斑克隆株系的建立及验证以家蚕胚胎细胞系（BmE-SWU1）为病毒培养载体，利用中性红染色的方法对BmNPV GD株进行了空斑克隆，经扩大培养，获得GD株空斑克隆株系。根据BmNPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性分析，选出其中SNP位点较多的gcn2（General Control Nonderepressible2）基因，用于验证BmNPV GD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPV GD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因，经T-克隆后测序;将两株病毒的gcn2基因分别进行单核苷酸多态性（SNP）位点分析，发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个，而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后则未发现多态性位点，说明空斑克隆株经纯化后，病原基因组的纯粹性得到提高，病原得到了纯化。 ***基因的同源性分析分析bro基因在各病毒株基因组中的分布情况，bro基因主要分布在基因组的三个区域，以T3基因组的bro分布为标准，CQ1株在第二个区域缺失bro-b基因，GD株在第三个区域缺失bro-e基因，而bro-d基因在几株病毒中都存在。以BmNPVGD株空斑克隆株的基因组为模板，扩增出bro-a，RegionⅡ（主要包括bro-b和bro-c基因），bro-d三个片段。与GenBank数据库中BmNPV bro基因序列及本实验室测定的CQ1株的bro基因序列进行比较分析，结果表明BmNPV GD株bro基因存在插入及缺失，bro基因同源性较高，差异主要集中在其氨基酸序列的N端部分。经ANTHEPRO5.0软件预测GD株BRO蛋白均无跨膜区和信号肽。 ***基因的系统发育分析与功能分析采用邻接法进行的bro基因的系统发育分析表明，GD株bro基因分别位于3个亚组中，GD株bro-d与日本T3株、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A;其bro-a,c与T3株、CQ1株bro-a,c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B;其bro-b与T3株、CQ1株bro-b,e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C，C亚组的bro基因与A亚组和B亚组的bro基因具有较大的进化分歧，bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征，进一步支持了Kang等的观点：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测bro-b和bro-e功能可能是互补或相同，SC7株的3个bro基因可能是BrnNPV bro家族出现的最简约形式。另外，GD株BRO蛋白N端序列符合前人发现的保守序列模式，但也发现其C端也是高度保守的。在GD株和CQ1株的bro基因中都发现了早期基因启动子结构域C（T）AGT，说明bro基因在病毒感染早期表达。

关键词： BmNPV 空斑克隆 bro基因系统发育地理分布

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