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穴状稀土螯合剂的免疫标记技术研究

穴状稀土螯合剂的免疫标记技术研究

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作者：孙延文吉林大学

学位级别：硕士

目的本研究旨在合成理想的穴状稀土螯合剂,并用于甲胎蛋白单克隆抗体(AFP-McAb)的标记,同时对标记的最佳条件进行探索,以检验自合成的穴状稀土螯合剂用于标记抗体的效果,为生物分子的标记提供参考,为进一步构建均相时间分辨荧光免疫分... 详细信息

目的本研究旨在合成理想的穴状稀土螯合剂,并用于甲胎蛋白单克隆抗体(AFP-McAb)的标记,同时对标记的最佳条件进行探索,以检验自合成的穴状稀土螯合剂用于标记抗体的效果,为生物分子的标记提供参考,为进一步构建均相时间分辨荧光免疫分析奠定基础。方法以2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸乙酯为原料,优化合成Li+(?)2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸乙酯(Li+(?)bpy.***.py(CO2Et)2),进一步选择乙腈和甲醇两种反应体系合成 Eu3+(?)2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸乙酯(Eu3+(?)bpy.***.py(CO2Et)2),比较不同反应体系下合成的铕螯合物的光谱性质。将EU3+(?)bpy.***.py(CO2Et)2水解后的铕螯合剂Eu3+(?)2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸(Eu3+(?)bpy.***.py(CO2H)2)作为示踪物,经交联剂EDC和NHS活化用于偶联AFP-McAb,通过标记抗体的荧光强度、标记率和相对免疫活性来评价标记的效果,获得铕螯合剂最佳的活化时间、偶联时间、反应pH以及反应比例。结果通过改变起始反应物的浓度,Li+(?)bpy.***.py(CO2Et)2的产率明显提高至51%。两种反应体系所得Eu3+(?)bpy.***.py(CO2Et)2的激发光谱(最大激发波长为310nm)、发射光谱(最大发射波长为616nm)、量子产率基本相同;荧光强度在4.0 × 10-8-2.5 × 10-5mol/1范围内与其浓度均成线性,相关系数分别为0.99373和0.98665;荧光寿命分别为825 μs、830 μs;乙腈反应体系合成的Eu3+(?)bpy.***.py(CO2Et)2的荧光强度略高。铕螯合剂标记AFP-McAb的最佳活化时间为24h,偶联时间为24h,反应pH为9,反应比例为60:1。结论两种反应体系均可合成荧光强度高、稳定性强的双功能穴状稀土螯合剂,可用于AFP-McAb的标记,获得了荧光强度强、免疫活性好的标记抗体,为进一步建立均相时间分辨荧光免疫分析奠定了基础。

关键词：穴状稀土螯合剂光谱性质免疫标记甲胎蛋白单克隆抗体均相时间分辨荧光免疫分析

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