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作者：李红平福建农林大学

学位级别：硕士

水稻顶端穗退化往往会导致秃尖现象的发生,因而带来穗粒数减少,单株产量降低,低结实率,产量大幅下降。因此,引起了许多育种家的重视,但其遗传基础并不十分清晰。本实验利用SSR和INDEL分子标记技术结合BSA分析法来对顶端小穗退化突变体ts... 详细信息

水稻顶端穗退化往往会导致秃尖现象的发生,因而带来穗粒数减少,单株产量降低,低结实率,产量大幅下降。因此,引起了许多育种家的重视,但其遗传基础并不十分清晰。本实验利用SSR和INDEL分子标记技术结合BSA分析法来对顶端小穗退化突变体tsr基因定位和候选基因的克隆。主要研究结果如下：(1)tsr突变体穗顶部的颖花发育不完整,在成熟的后期这些发育不完整的颖花变干脱落,呈现形态上的秃穗。与原品种168比较,tsr突变体的株高较矮,稻穗变小、粒数减少、结实率降低,且存在包颈现象。(2)遗传分析表明,该顶端小穗退化突变体受一对隐性核基因控制。(3)将顶端小穗退化突变体与籼稻品种5364s杂交后自交的F2代作为定位群体。采用BSA和SSR分子标记相结合的方法将穗退化基因初步定位在第3号染色体短臂RM157A处。(4)通过Indel引物的设计,最终将穗退化基因精细定位在两个紧密连锁的Indel分子标记hc42和hc58的67kb之间,该区间共有9个候选基因。(5)对候选基因Os03g0319300和Os03g0320000测序,结果发现Os03g0320000基因的第129氨基酸位点发生C→G的点突变,由丙氨酸变为甘氨酸。

关键词：穗顶端退化 tsr 插入缺失标记基因定位候选基因

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水稻穗顶端退化突变体paa21的表型分析及基因克隆

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中国农业科学 2022年第24期55卷 4781-4792页

作者：赫磊路凯赵春芳姚姝周丽慧赵凌陈涛朱镇赵庆勇梁文化王才林朱丽张亚东江苏省农业科学院粮食作物研究所/国家耐盐碱水稻技术创新中心华东中心/江苏省优质水稻工程技术研究中心/国家水稻改良中心南京分中心/江苏省农业生物学重点实验室中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室

【目的】水稻穗顶端退化严重影响产量，鉴定与克隆水稻穗顶端退化相关基因，可以丰富水稻穗发育调控的分子机理，为水稻高产分子设计育种提供理论基础和基因资源。【方法】从粳稻品种武运粳30号EMS突变体库筛选到一份稳定遗传的穗顶端... 详细信息

【目的】水稻穗顶端退化严重影响产量，鉴定与克隆水稻穗顶端退化相关基因，可以丰富水稻穗发育调控的分子机理，为水稻高产分子设计育种提供理论基础和基因资源。【方法】从粳稻品种武运粳30号EMS突变体库筛选到一份稳定遗传的穗顶端退化突变体panicle apical abortion 21(paa21)。对退化一次枝梗比例、每穗退化粒数占比、每穗粒数、株高、穗长、单株产量等农艺性状进行统计。使用台盼蓝和伊文思蓝染色检测顶端小穗是否发生程序性细胞死亡。测定WT和paa21不同发育时期幼穗和不同穗部位的H2O2含量。paa21分别与籼稻II-32B、9311正反交进行遗传分析。利用paa21与籼稻II-32B杂交构建的F2群体进行基因定位和克隆。使用SWISS-MODEL网站预测野生型和突变体蛋白的三维结构。利用RT-qPCR分析ROS响应标志基因、程序性细胞死亡相关基因、过氧化氢酶相关基因的表达量。【结果】paa21突变体发生严重的穗顶端退化，统计paa21所有一次枝梗退化情况，发现退化小穗主要位于顶端的一次枝梗上。与WT相比，paa21的株高、每穗粒数、穗长和单株产量均降低。通过观察不同发育时期的幼穗，发现在paa21突变体幼穗发育至12 cm时，可见穗顶端退化表型。台盼蓝和伊文思蓝染色结果表明突变体顶端小穗发生程序性细胞死亡。在退化的paa21顶端小穗中观察到更强烈的DAB染色；H2O2含量测定结果表明，与WT相比，paa21穗中积累更高水平的ROS。遗传分析表明paa21突变表型受一对隐性核基因控制。图位克隆结果发现paa21中Os02g0673100第二外显子发生一个C到T的突变，导致丙氨酸突变为缬氨酸。该基因编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白ALMT7。突变位点位于第4个跨膜螺旋上。SWISS-MODEL预测结果表明，该突变位点并未对突变体蛋白三维结构造成明显影响。RT-qPCR结果表明，在幼穗发育至10 cm时，paa21中ROS响应标志基因Os01g0826400、Os05g0474800和Os02g0181300，程序性细胞死亡相关基因VPE2和VPE3，过氧化氢酶编码基因CATA、CATB、CATC的表达量较WT大幅升高。此外，paa21 10 cm幼穗中过氧化氢酶(CAT)的活性较WT明显下降。【结论】paa21幼穗在发育后期顶端小穗中积累过量的ROS，产生程序性细胞死亡，最终导致顶端小穗发生退化。

关键词：水稻穗顶端退化活性氧程序性细胞死亡

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水稻穗顶端退化突变体paa2突变基因的精细定位

水稻穗顶端退化突变体paa2突变基因的精细定位

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作者：李真中国农业科学院

学位级别：硕士

穗顶部退化现象在水稻品种中时有发生,造成穗子大小和穗粒数大幅度下调,严重影响水稻的产量。由于穗退化易受穗分化期间温度、湿度等环境条件的影响,表型鉴定困难或不稳定,因而关于它的遗传研究很少。我们从水稻组织培养中获得了一个水... 详细信息

穗顶部退化现象在水稻品种中时有发生,造成穗子大小和穗粒数大幅度下调,严重影响水稻的产量。由于穗退化易受穗分化期间温度、湿度等环境条件的影响,表型鉴定困难或不稳定,因而关于它的遗传研究很少。我们从水稻组织培养中获得了一个水稻穗顶端退化突变体paa2,该突变体穗部表现严重退化,小穗的一级枝梗数,二级枝梗数和每穗粒数较野生型减少,严重影响水稻的产量。我们分别利用两个F2代群体,通过图位克隆的方法对paa2穗顶端退化引发的基因PAA2进行了精细定位,为进一步的基因克隆奠定了基础。主要研究结果如下：1.突变体在幼穗发育早期和正常植株并无明显差异,在孕穗后期,稻穗顶部的小穗退化死亡,在北京和海南不同的生长季节种植,此表型都能够稳定遗传。抽穗后,突变体顶部的退化小穗表现为发白、变干,连同退化的枝梗一起掉落。收获时,突变体的稻穗小、粒少、产量低,与野生型相比,paa2在分蘖数和千粒重上和野生型相比没有显著的变化。但在株高、主穗长、每穗实粒数、初级枝梗数、二级枝梗数方面上有显著的差异。2.遗传分析表明,paa2穗顶端退化表型是由一对显性基因控制的。我们通过分离群体分组的方法筛选出了与PAA2位点连锁的两个标记L2-20,L2-44。用“paa2x岳晚籼”定位群体的1850个极性单株,将PAA2定位在SSR标记L2-33和L2-50两个标记之间,物理距离为80Kb的区间内。在定位区间内包含10个候选基因,对这10个候选基因进行测序,结果表明突变体与野生型相比并未发生核苷酸序列的改变。3.为了验证精细定位的结果,我们又利用了遗传背景更为单纯"IRAT129×paa2”(两个粳稻品种间的杂交)的群体,对该突变基因重新进行精细定位。在初定位基础上,利用多态性标记把PAA2基因重新定位在标记L27-3和L27-4之间,遗传距离为126Kb,在这区间内有13个候选基因。我们对区间内的基因全部进行了测序,测序结果表明,在野生型和突变体之间仍没有核酸序列的改变。4.为了确定目的基因,我们对10个候选基因进行了RT-PCR分析。结果表明Os02g45100, Os02g45140, Os02g45160三个基因的表达量在突变体中明显升高。根据基因表达分析结果,我们把候选基因锁定在Os02g45100, Os02g45140, Os02g45160这三个基因上,但仍需要进一步的转基因结果验证。

关键词：水稻穗顶端退化突变体精细定位基因表达

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水稻穗顶端退化基因PANICLE APICAL ABORTION 3（PAA3）的图位克隆与功能研究

水稻穗顶端退化基因PANICLE APICAL ABORTION 3（PAA3）的图位克...

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作者：杨发钰西南大学

学位级别：硕士

在水稻(Oryza sativa)中,穗顶部退化会造成水稻单穗枝梗数和总粒数减少,从而影响水稻的产量。因此,了解穗退化的分子机制对提高产量至关重要。水稻在生长过程中会经历一系列的不利条件,比如激素比例失调、过氧化物积累等因素影响穗的发... 详细信息

在水稻(Oryza sativa)中,穗顶部退化会造成水稻单穗枝梗数和总粒数减少,从而影响水稻的产量。因此,了解穗退化的分子机制对提高产量至关重要。水稻在生长过程中会经历一系列的不利条件,比如激素比例失调、过氧化物积累等因素影响穗的发育并导致穗的退化。到目前为止,已报道的穗退化基因较少,因此用穗退化突变体去开发穗退化相关基因,对了解穗顶端退化形成的分子机制和分子育种具有重要意义。本实验室从EMS诱变西大1B获得的突变体库中鉴定到一个突变体,其表现为穗顶部自上而下的退化,根据其表型特征将其命名为paa3(panicle apical abortion 3),我们用它和不育系56s进行杂交得到子一(F)代,F代再进行自交以获得子二代(F)代,F代出现性状分离,经过统计和卡方检验发现其正常表型和突变体表型的分离比近似等于3:1,暗示该性状受一对单隐性基因控制。采用图位克隆对水稻PAA3基因进行了精细定位,并通过遗传互补进行了验证。本研究结果如下:1,较野生型而言,突变体从苗期开始到成熟期都表现出半矮化表型,对其进行具体分析之后,发现突变体每一节间都比野生型短,同时突变体穗长也短于野生型,后续研究发现突变体中缩短的穗长是由于退化的顶部造成的,拷种数据显示相对于野生型,突变体的一次枝梗数、二次枝梗数、单穗颖花数、结实率和千粒重均减少,这表明PAA3基因的突变会很大程度上使水稻减产。2,我们对其退化顶穗的发生时期进行了详细地观察,按穗长不同,将他们分为不同的时期,分别为1,3,5,7,9,11,13,15和17cm。发现其在穗长约等于11cm时便能观察到有退化的表型,体式镜观察表明,与野生型相比,突变体穗长为11cm时,顶部颖花便发生萎缩,随着穗长的增长,其程度越来越大,到17cm时能观察到直接干枯了,TUNEL结果显示在穗长约为11cm时,能在突变体的穗顶端颖花上检测到DNA断裂的信号,paa3穗顶部小穗的丙二醛含量和过氧化氢含量高于野生型,Os VPE2和Os VPE3是与细胞程序性死亡相关的的两个基因,这两个基因的表达水平也显著上调,响应过氧化氢积累的过氧化物酶的同工酶基因CATA,CATB和CATC的表达量也显著上调,这便暗示paa3的退化表型是由于ROS的积累所诱发的PCD导致的。3,利用图位克隆结合重测序的方法,我们将PAA3基因定位在第四染色体的长臂端介于分子标记CHR4-P118-6和CHR4-P118-9之间物理距离为88kb的区域内,我们在这88kb的区域内发现基因LOC＿Os04g56160的第13外显子上发生由G到A单碱基的替换,使得第814个氨基酸由Gly变为Asp,遗传互补验证表明LOC＿Os04g56160就是引起穗顶部退化的目标基因PAA3,PAA3基因编码质膜H-ATP酶(H-ATPase),在水稻原生质体和烟草细胞中瞬时表达PAA3蛋白,并将PAA3定位在细胞膜中,q RT-PCR结果显示PAA3基因在水稻的根、茎、叶、鞘和穗中普遍表达,在茎和穗中呈现较高的表达。用PAA3基因的启动子加GUS基因转化ZH11,对得到的转基因植株进行GUS染色分析,染色结果与之前的q RT-PCR结果一致,在水稻各部位都能检测到GUS信号,在茎和穗部,以及穗顶端颖花上能发现较强的GUS信号。4,在本研究中,突变体paa3在穗顶端发生小穗退化,观察到穗顶端小穗在11cm时开始发育迟缓,败育表型在13-17cm时逐渐明显,与野生型相比,在13cm左右的穗部,paa3顶端退化的小穗DAB染色更强烈,在11cm处paa3穗部出现过量的HO积累同时MDA含量也比较高,表明ROS在paa3穗中过度积累。q RT-PCR结果显示,突变体小穗中Os CATA、Os CATB和Os CATC的表达量高于WT,这三个基因属于过氧化氢酶的同工酶基因,可以参与生物防御系统,将过量的HO转化为氧气。与WT相比,paa3突变体小穗11cm处Os VPE2和Os VPE3这两个与细胞程序性死亡相关的基因的表达显著增加,在约13cm处paa3小穗的台盼蓝染色结果比野生型更深。此外我们还对转录组数据进行了分析,结果显示,与氧化反应(GO:0006979)和氧化还原酶活性(GO:0016705)相关的基因在野生型和paa3中存在差异表达。这些结果表明paa3穗顶端ROS的过度积累可能在穗发育的后期触发PCD。

关键词：水稻(Oryza sativa) 穗顶端退化 paa3突变体图位克隆 H+-ATP酶

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