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稻黄单胞菌蔗糖转运载体以及三个XOP蛋白病理学功能研究

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稻黄单胞菌蔗糖转运载体以及三个XOP蛋白病理学功能研究

作者：宿爱凤南京农业大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoc)分别引起水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight,BLB)和水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak,BLS)。三型分泌系统(Type Ⅲsecretion system,T3SS)效应物(Effector)是水稻黄单胞菌最重要的致病因子,是细菌和寄主互作中具有决定性作用,决定细菌能否从寄主中获取养分以及抵抗寄主的防卫反应,最终决定病害的产生。T3SS效应物分为TAL(Transcriptionactivator-likeeffectors)效应物和non-TAL 效应物(Non transcription activator-like effectors)两大类。前者进入寄主细胞核后结合在寄主基因的启动子上,激活寄主抗病基因或感病基因的表达,诱导抗病或促进病害的发生。在Xoo菌株中发现Tal效应蛋白激发的感病基因是一类编码蔗糖转运蛋白的SWEET基因的表达,推测Xoo通过提高寄主向细菌生长的的非原质体空间转运蔗糖是细菌获取养分进而扩展、产生病害的重要机制。因此蔗糖的获取和代谢对Xoo的致病性具有决定作用。蔗糖代谢基因簇同样存在于Xoc菌株中,那么蔗糖代谢基因是否对Xoc的致病性具有类似的作用还不清楚。non-TAL基因包括编码Xop蛋白(Xanthomonas outer protein)的xop基因和编码蛋白经T3SS途径分泌的除TAL效应子外的其他基因,如Xoc含有的avrRxo1。现阶段的研究和生物信息学分析表明,一些Xop蛋白可能具有酶类活性或参与调控寄主植物的防卫反应信号,其中一些xop基因的功能具有品种选择性,因此XOP蛋白在细菌-寄主的互作中也具有重要作用。本文比较研究了Xoc菌株RS105和Xoo菌株PX099A蔗糖代谢基因簇的功能和Xoc菌株特有的3个Xop基因对细菌致病性的影响。在菌株Xce ATCC3313研究中发现Sux(Sucrose utilization in Xanthomonas)与细菌毒力相关,该基因簇参与蔗糖的吸收和代谢。,Sux基因簇编码一个非磷酸转移酶PTS(Non-phosphotransferase)蔗糖途径,Sux基因簇包含有两个MFS(MajorFacilitator Super)转运子SuxA和,SuxC,一个分解代谢基因,SuxB以及一个调控基因SuxR,该基因簇使细菌适应特定条件下它们所处的营养环境。基因簇,Sux旁侧的PXO02417编码一个ThiJ/PfpI家族的蛋白,推测其参与维生素B1合成,与细菌的生长有关,是否与糖类物质的利用和细菌的致病性有关还不清楚。本研究中我们利用同源臂双交换的方法敲除RS105(Xoc)和PX099A(Xoo)中的Sux基因并进行基因回补,获得RS105ΔSuxR、RS105ΔSuxC、RS105ΔSuxB、RS105ΔSux cluster 以及PXOΔSuxC、PX0Δ02417、PXOΔSux cluster缺失菌株和C-RS105ΔSuxR回补菌株。检测野生型菌株在蔗糖、葡萄糖作为碳源条件下的生长速率表明,蔗糖和葡萄糖中细菌的生长快,表明细菌偏好蔗糖和葡萄糖。菌落形态测定表明,蔗糖对胞外多糖的产生更加有利。同时对野生型菌株在各种糖培养基中Sux基因的表达进行了研究,结果表明蔗糖诱导Sux基因的表达,而其他糖份抑制Sux基因的表达。单个基因SuxB和SuxC及整个Sux基因簇缺失使细菌RS105以及PX099在蔗糖培养基中的生长速率降低,而在葡萄糖中的生长速率与野生型菌株没有差异,因此Sux基因簇是蔗糖代谢特异基因簇,对细菌的生长具有重要作用,但该基因簇的缺失对细菌对葡萄糖的吸收和利用没有影响。在日本晴水稻上的致病力测定表明PX099的Sux基因簇中不同基因的缺失突变体致病力表现不同程度的下降,因此PX099蔗糖代谢与细菌的毒力相关。但RS105菌中Sux基因的缺失导致细菌毒力的明显增强,这说明Xoc细菌在植物中获取的主要养分可能并不是蔗糖,部分原因来自于水稻细条斑病和白叶枯病发生的组织特异性的差异。参与生长物质维生素B1合成的基因PXO02417缺失后与野生型菌株PX099A相比,PXOΔ02417突变菌株对日本晴水稻的致病力没有显著差异,这说明维生素B1对细菌的致病性没有明显影响。在烟草上的过敏反应测定表明,缺失Sux基因簇后诱导非寄主过敏反应的能力与野生型比较没有显著差异,因此Sux基因簇不影响T3SS途径的其他效应子的泌出。XopAF、XopAK、XopO 3个蛋白是Xoc菌株特有的,而Xoo菌株中没有,基因组数据

关键词：稻黄单胞菌 Sux基因 Xop基因致病力

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稻黄单胞菌碳代谢在致病性中的作用研究进展

浙江师范大学学报（自然科学版） 2017年第1期40卷 71-78页

作者：郭威邹丽芳陈功友浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004 上海交通大学农业与生物学院上海200240

碳代谢是稻黄单胞菌体内最基本的代谢之一.碳源的获取对于病原菌在寄主水稻体内成功建立寄生关系和生长繁殖尤为重要.营养驱动是稻黄单胞菌与水稻互作的重要方面,并且与其他致病性决定因素,如Ⅲ型分泌系统(T3SS)等常相关联.为此,对稻黄... 详细信息

碳代谢是稻黄单胞菌体内最基本的代谢之一.碳源的获取对于病原菌在寄主水稻体内成功建立寄生关系和生长繁殖尤为重要.营养驱动是稻黄单胞菌与水稻互作的重要方面,并且与其他致病性决定因素,如Ⅲ型分泌系统(T3SS)等常相关联.为此,对稻黄单胞菌碳代谢的途径与功能、碳代谢途径中编码催化酶基因的生物学特性,以及碳代谢与hrp(hypersensitive response and pathogenicity)系统、群体感应(quorum sensing,QS)的关联性等方面进行了归纳,对利用碳代谢途径防控水稻细菌病害的可能性进行了展望.

关键词：水稻稻黄单胞菌碳代谢生物学特性

pilT基因和tal基因在稻黄单胞菌致病性中的作用研究

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pilT基因和tal基因在稻黄单胞菌致病性中的作用研究

作者：杨阳阳上海交通大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)和水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)是稻田生态系统中两种重要的细菌性病害,严重制约我国水稻粮食生产安全。该两种病害分别由稻黄单胞菌种下的两个致病变种Xanthomonas oryzae ***(Xoo)... 详细信息

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)和水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)是稻田生态系统中两种重要的细菌性病害,严重制约我国水稻粮食生产安全。该两种病害分别由稻黄单胞菌种下的两个致病变种Xanthomonas oryzae ***(Xoo)与Xanthomonas oryzae ***(Xoc)引起。为了揭示稻黄单胞菌的致病性机理,本文对其pilT和tal基因在致病性中的作用进行了系统研究。***基因在稻黄单胞菌致病性中的作用本实验室前期研究发现,Xoc RS105菌株中pil T基因插入突变体在寄主水稻上致病性明显降低,在非寄主烟草上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)的能力减弱。为了揭示pil T基因在Xoc中的功能,通过无标记双交换敲除的方法构建pil T基因缺失突变体RΔpil T,并对该突变体的游动性以及生物膜等表型进行了检测。结果显示:与野生型菌株RS105相比,敲除突变体RΔpil T不仅在感病水稻IR24上的致病性显著降低,在非寄主烟草上产生过敏反应的能力减弱,而且突变体游动性降低,生物膜含量增加,互补子能够恢复上述缺陷至野生型水平。q RT-PCR结果显示,在RΔpil T中,hrp G、hrp X、hrc C、clp、rpf G、pil A、pil C基因表达量明显降低。Xoc中pil T为重要的毒性相关基因,其致病性与游动性和生物膜含量变化相关,并且涉及调控clp、rpf G、pil A、pil C等基因的表达。对pil T基因的功能研究,为进一步研究IV型菌毛在Xoc中的功能提供了线索。2.水稻白叶枯病菌tal基因的多样性分离和搜集来自我国9个不同水稻生态种植区的125株Xoo菌株,以tal基因中间区域的Sph I片段为探针,进行了Southern杂交。结果显示,不同的Xoo菌株既有相同的tal基因,也含有不相同的tal基因。在不区分信号条带强弱的情况下,根据杂交条带位置不同,这些菌株含有26个不同类型的tal基因,并划分为19个tal基因型。在含有已知抗病基因的水稻近等基因系(Near Isogenic Lines,NILs)上接种这些菌株,毒性测定结果表明,IRBB5、白香占、IRBB7、CBB23这4个水稻品种对绝大部分供试菌株呈现抗病性(非亲和性互作),而IRBB4、IRBB10、IRBB13、IR24、87-15和Nipponbare对多数供试菌株表现为感病性(亲和性互作)。毒性测定结果还显示,对IRBB5、白香占、IRBB7和CBB23表现感病症状的Xoo菌株所含tal基因有所不同。3.水稻白叶枯病菌AH28克服Xa23抗性的机理分析125株Xoo菌株接种含有Xa23基因的CBB23水稻后发现,AH28菌株能够与广谱抗性的CBB23水稻发生亲和性互作,形成的病斑平均长度达到15.8cm。分离tal基因并测序分析后发现:AH28菌株中不存在与Xa23匹配的avr Xa23相似基因。将无毒基因avr Xa23导入AH28后,能使其与CBB23的亲和性互作转变为非亲和性互作。qRT-PCR结果显示,Xa23基因在AH28菌株侵染时没有被激活表达。4.抗xa5的OXBB菌株的tal基因分离苗期注射接种发现,水稻白叶枯病菌OXBB菌株与IRBB5(xa5)水稻互作,表现为非亲和性互作。为了确定某个tal基因决定了OXBB菌株与IRBB5的非亲和互作关系,利用菌落原位杂交的方法分离获得了16个tal基因,通过酶切验证、Southern杂交以及部分测序对这些tal基因进行了精确分析。最后将这些tal基因构建到表达载体上并置于tal-free菌株PH菌株中,以便后续研究。

关键词：稻黄单胞菌 pilT基因 tal基因致病性抗病性

检测西瓜噬酸菌和稻黄单胞菌的环介导等温扩增技术及荧光定量PCR方法的建立

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检测西瓜噬酸菌和稻黄单胞菌的环介导等温扩增技术及荧光定量PCR...

作者：白飒南京农业大学

学位级别：硕士

西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xooc)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)均为我国重要的检疫性种传细菌病害。目前,西瓜噬酸菌已对我国的瓜类生产及相关... 详细信息

西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xooc)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)均为我国重要的检疫性种传细菌病害。目前,西瓜噬酸菌已对我国的瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁,而稻黄单胞菌也对粮食生产带来了不利的影响。鉴于此,建立简便、快捷、高效的检测技术是防治这三种病害传播扩散的有效措施。本实验采用了Taqman荧光定量PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)两种检测方法,针对这三种病原物分别设计了特异的探针和引物,并对其纯培养物和实地样品进行了特异性、灵敏度、实地样品等方面的检测,同时对比评价了这两种检测手段。结果表明：在***的检测中,LAMP技术和荧光定量PCR方法均可有效的区分开Acidovorax avenae(燕麦褐条病菌)、Acidovorax facilis(敏捷噬酸菌)、Acidovorax konjaci：魔芋噬酸菌)及Acidovorax cattleyae(卡特莱兰褐斑病菌)等亲缘近种,且检测到的种子带菌率为0.1%(1/1000),另外,可从13种新疆市售种子中检出6份种子携带***。在水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的检测中,探针Xooc-Probe及Xoo-Probe均有效的区分开了白叶枯病菌和条斑病菌,LAMP技术同样实现了特异性扩增,对健康水稻种子和发病区的种子进行检测,条斑病菌的两种检测方法均可从2份市售种子中检出2份种子携带条斑病菌,从2份自然发病种子中检出1份种子带菌,从7份发病区接种白叶枯病菌获得的种子中检测到0份种子带菌。白叶枯病菌的两种检测手段可从2份市售种子检出0份种子携带白叶枯病菌,从2份自然发病种子中检出1份种子带菌,从7份发病区接种白叶枯病菌获得的种子中检测到4份种子带菌。对于Taqman荧光定量来说,三种病原菌最终检测限度均为2.0×101cps/μL,而LAMP的检测最低限均为2.0×102cps/μL,显然荧光定量的检测灵敏度比LAMP高10拷贝数。另外在本实验中,荧光定量的检测时长为2h,环介导等温扩增技术的检测时长为40min～60min,在特异性相同、实地样品检测结果一致的情况下,综合考虑检测周期、检测成本和应用性等特点,环介导等温扩增技术更适合植物病原物的检测,亦更适于基层检疫机构的推广应用。

关键词：西瓜噬酸菌稻黄单胞菌 LAMP 荧光定量检测

内生细菌2P对稻黄单胞菌所致病害的生防效果及抑病机制的研究

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内生细菌2P对稻黄单胞菌所致病害的生防效果及抑病机制的研究

作者：王冰倩南京农业大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病（Bacterial leaf blight,BLB）以及水稻细菌性条斑病（Bacterial leaf streak,BLS）是严重危害水稻生产的两种细菌性病害,分别由革兰氏阴性细菌稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）和稻生致病变种（***,... 详细信息

水稻白叶枯病（Bacterial leaf blight,BLB）以及水稻细菌性条斑病（Bacterial leaf streak,BLS）是严重危害水稻生产的两种细菌性病害,分别由革兰氏阴性细菌稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）和稻生致病变种（***,Xoc）引起。本课题组在前期的研究中从水稻中分离并鉴定了一株短小杆菌属内生细菌2P,该菌在与白叶枯病菌PXO99或细条病菌RS105混合接种水稻IR24时显著抑制白叶枯和细菌性条斑病害的发生。在NB液体培养基中共培养后,2P显著抑制这两病原菌生长,但平板实验显示,2P对稻黄单胞菌的抑制特性与它的代谢产物及挥发性物质无关。在上述研究基础上,本课题进一步探究了2P的寄主范围以及2P处理对杂交水稻深两优871的促生效果。利用2P浸种和喷雾两种方法处理对白叶枯病和细条病害的生防效果进行测定,并从植物和病原细菌两方面探究了2P抑制病害的机理。本研究取得的主要成果如下:1.检测了2P对大田常见作物玉米、辣椒、小麦、甜叶菊、豌豆、棉花、大豆、番茄以及油菜的致病性,结果发现注射接种OD为0.01的2P菌液后,在上述植物上没有引起可见的症状表现。用2P处理种子后可以促进水稻深两优871种子萌发后的根和芽的生长,说明2P作为水稻的内生菌具有潜在的生防价值。2.将2P进行浸种处理,其对水稻的整体长势以及水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病的抑病效果均不理想,但2P与病原菌混合接种后引起的病害发生程度显著减轻;而通过喷雾2P的方式能明显减轻水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病的发生。这些结果显示喷雾处理是用2P进行生防应用的一种合适施用方式。3.通过检测在烟草上诱导过敏性反应、激发活性氧迸发及胼胝质沉积的情况,结果发现2P均不会引起以上3种反应,这说明2P对水稻细菌病害的抑制不是通过诱导植物的基础防卫反应。4.为揭示混合培养时2P对PXO99生长抑制的作用机制,首先测定了2P单独培养或与PXO99共培养20小时后的培养上清液对PXO99的抑制作用,结果显示无论是单独培养或与PXO99共培养条件下,2P均不产生抑菌性的代谢产物。其次测定了2P的胞内蛋白对PXO99的抑制作用,结果显示2P对PXO99的影响也不是通过胞内蛋白起作用的。利用GPF标记的PXO99在平板上测试其与2P菌的互作,结果显示2P对PXO99的抑制需要以细胞间的直接接触为条件。5.根据对2P的基因组成分析,测定了2P中的3个可能的毒素蛋白对PXO99的影响,结果显示2P中的Rhs B蛋白抑制PXO99的生长且Rhs B毒素蛋白能与对应的免疫蛋白发生互作,中和毒性。综上所述,通过本研究确定了2P对主要的大田植物没有致病性;喷雾处理后2P对稻黄单胞菌所致病害具有显著的抑制作用。探究了2P对病害的抑制不是通过诱导植物的基础抗性,而可能是通过在2P细胞与病菌细胞接触时2P中的毒素蛋白对病原菌具有毒害作用。本研究的开展为进一步揭示内生细菌2P抑制BLB和BLS病害的机制提供了线索,而且为更有效地开发和利用内生细菌资源进行水稻病害的防治提供了理论依据和实验基础。

关键词：内生细菌促生作用抑病机制接触依赖的生长抑制稻黄单胞菌

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水稻抗细菌性条斑病基因挖掘与初定位

植物学报 2024年第1期59卷 1-9页

作者：方妍力田传玉苏如意刘亚培王春连陈析丰郭威纪志远浙江师范大学生命科学学院金华321004 中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程北京100081

由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)引起的细菌性条斑病(BLS)是水稻(Oryza sativa)生产上的重要病害,近年来其发病呈快速上升趋势,特别是在我国南方(包括江苏、浙江、福建和广东等地)稻区危害严重。种植... 详细信息

由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)引起的细菌性条斑病(BLS)是水稻(Oryza sativa)生产上的重要病害,近年来其发病呈快速上升趋势,特别是在我国南方(包括江苏、浙江、福建和广东等地)稻区危害严重。种植抗病品种是防治BLS最理想的措施,但目前生产上严重缺乏可用于育种的优异抗病基因资源。通过人工接种鉴定筛选水稻种质资源,挖掘到2份高抗BLS材料(M1和D1)。多菌株系接种结果表明,M1具有非小种特异性广谱抗病(RNS BSR)特征。经遗传群体分析表明,栽培稻M1携带单个显性抗BLS新基因Xo-3。通过混池测序和关联分析,将Xo-3基因初步定位在2号染色体上的一段候选区域内。抗BLS种质资源的挖掘及其抗性遗传基础的解析,将有助于理解水稻-Xoc互作机理,从而培育抗BLS水稻新品种和制定科学的防治BLS策略。

关键词：细菌性条斑病种质资源抗病基因水稻稻黄单胞菌

GNAT类乙酰转移酶调控水稻细菌性条斑病菌的生长和致病力

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热带生物学报 2024年第2期15卷 171-181页

作者：陈雨程雨果蔡静陶均海南大学热带作物学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室海口570228

为探究GNAT乙酰转移酶在稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中的功能,本研究首先对GNAT家族蛋白进行了结构域分析,随后构建了GNAT编码基因的单突及多突突变体,并比较了野生型菌株和这些突变菌株间的生长速... 详细信息

为探究GNAT乙酰转移酶在稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中的功能,本研究首先对GNAT家族蛋白进行了结构域分析,随后构建了GNAT编码基因的单突及多突突变体,并比较了野生型菌株和这些突变菌株间的生长速度、胞外酶活性和致病力的差异。结果发现:在营养缺乏条件下,除xoc_1598突变体和敲除全部GNAT类乙酰转移酶基因的6突突变体外,其他所有突变体的生长都弱于野生型,说明此类乙酰转移酶调控Xoc的生长。此外,所有GNAT类乙酰转移酶突变都导致Xoc致病力下降。同时还发现此类乙酰转移酶对运动性、胞外蛋白酶和淀粉酶活性也有调控作用。实验结果表明,乙酰化修饰是Xoc生长和致病力的重要调节机制。

关键词：稻黄单胞菌乙酰转移酶胞外酶致病性

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我国水稻白叶枯病和条斑病发生与防控研究进展

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植物保护 2023年第5期49卷 43-49页

作者：徐夏萌沈丽丽闫佳丽王勇徐正银陈功友上海交通大学农业与生物学院上海200240 光明食品集团上海川东农场有限公司种植业中心盐城224133

培育和种植抗病品种和研发新型绿色杀菌剂是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae致病效应蛋白调控水稻抗(感)病性研究取得了突破性进展,为水稻抗性品种培育提供了新思路、新策略。本文对稻... 详细信息

培育和种植抗病品种和研发新型绿色杀菌剂是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae致病效应蛋白调控水稻抗(感)病性研究取得了突破性进展,为水稻抗性品种培育提供了新思路、新策略。本文对稻黄单胞菌水稻互作系统中已知的TALE效应蛋白与水稻抗(感)病基因(R或S)的对应关系进行了归纳,就tal基因与水稻R或S基因的协同进化进行了分析,结合生物农药和高效低毒杀菌剂的应用现状,提出了我国水稻白叶枯病和水稻条斑病绿色防控关键策略。

关键词：水稻稻黄单胞菌白叶枯病条斑病 TALE蛋白绿色防控

一株生防假单胞菌新种的鉴定和其拮抗物质相关功能基因的分析

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