检索结果-南通市图书馆

作者：李广悦中国农业科学院

学位级别：硕士

PeaT1是本试验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化获得的一种蛋白激发子,其分子量约为36kD;前期工作克隆了该蛋白的基因peaT1并在大肠杆菌中进行了表达。研究表明,该蛋白具有促进小麦生长和诱导烟草抗TMV的功能。本研... 详细信息

PeaT1是本试验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化获得的一种蛋白激发子,其分子量约为36kD;前期工作克隆了该蛋白的基因peaT1并在大肠杆菌中进行了表达。研究表明,该蛋白具有促进小麦生长和诱导烟草抗TMV的功能。本研究在此基础上,以拟南芥为材料,对PeaT1提高拟南芥的抗旱性、耐盐性和对灰霉病的抗性作用、诱导拟南芥的信号反应以及诱导拟南芥的差异表达蛋白进行了研究,主要研究结果如下:1、PeaT1蛋白的表达与纯化。对PeaT1进行了原核表达,SDS-PAGE检测表明,表达蛋白的表观分子量约为36 kD。通过Western-Blotting检测分析显示,蛋白表达正确。采用了亲和层析,阴离子交换层析,分子筛层析的经典三步纯化法对表达蛋白进行了纯化,最终获得了纯度大于90%的蛋白,为后面实验提供了材料。2、PeaT1的生物学功能。通过实验设计对高纯度的PeaT1蛋白进行了生物学功能检测。结果表明,PeaT1具有增强拟南芥抗旱性、耐盐性和提高拟南芥对灰霉病的抗性作用。证明PeaT1是一种多功能的蛋白激发子。3、PeaT1激发拟南芥产生早期信号反应的研究。以拟南芥为材料对PeaT1诱导其产生的前期反应进行了测定,发现PeaT1能诱导拟南芥的活性氧爆发、PH变化、钙离子浓度提高、一氧化氮产生以及酚类化合物合成,为PeaT1作用机制的研究奠定了基础。4、PeaT1诱导拟南芥差异蛋白的研究。应用稳定同位素标记的方法对拟南芥植株进行了完全标记,然后进行了差异蛋白的质谱鉴定。质谱鉴定结果经过数据库比对并与MSQuant软件定量计算后对差异显著的蛋白进行了功能分析,发现这些蛋白与压力、病程、代谢、转运功能相关,分析表明PeaT1通过诱导这些蛋白的差异表达从而提高拟南芥的抗病抗逆能力。5、PeaT1诱导拟南芥差异表达蛋白的RT-PCR及缺失突变体验证。对重要差异蛋白谷胱甘肽转硫酶6和过氧化物酶52的编码基因进行了RT-PCR验证和缺失突变体验证。结果表明,经PeaT1处理的拟南芥的两个蛋白的编码基因转录上调,24小时转录水平达到最高;两种蛋白缺失突变体对灰霉病抗性都明显下降,说明PeaT1通过诱导这两种蛋白的上调表达而提高了拟南芥抗性。本研究利用蛋白质组学最新技术探讨了PeaT1激发拟南芥防卫反应的分子机制,为进一步阐明PeaT1的作用机理奠定了基础。同时获得的大量差异表达蛋白为抗病相关的关键基因的鉴定提供了重要信息。

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苯丙氨酸调控奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的机理研究

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作者：陈娇兰州大学

学位级别：硕士

“优质乳工程”是我国奶业进入转型增效的关键时期提出的发展策略,其核心理念是为消费者提供真正健康安全、营养丰富、品质优异的奶产品。研究人员通过大量实践,在奶牛优质乳营养调控等方面已取得了一定成果。但牛奶中依旧存在很多生物... 详细信息

“优质乳工程”是我国奶业进入转型增效的关键时期提出的发展策略,其核心理念是为消费者提供真正健康安全、营养丰富、品质优异的奶产品。研究人员通过大量实践,在奶牛优质乳营养调控等方面已取得了一定成果。但牛奶中依旧存在很多生物活性成分,其潜在的营养价值还未被深度挖掘。乳蛋白作为具有理想氨基酸比例的乳成分,在牛乳中的含量已成为衡量乳品质的重要指标。氨基酸不仅是乳蛋白合成的底物,也作为活性分子参与诸多生物学反应,充分了解氨基酸的多重作用是当下研究的关键。目前多数研究关注于限制性氨基酸:赖氨酸、蛋氨酸对奶畜经济效益的影响,对其它必需氨基酸鲜有报道。L-苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)作为具有生理活性的芳香族氨基酸,是泌乳牛潜在的限制性氨基酸之一。已有研究显示,与对照组相比奶牛皱胃灌注不含Phe的氨基酸混合物降低乳蛋白产量,表明Phe可能是影响乳蛋白合成的重要因素。但Phe调控乳蛋白质合成的机理仍不清楚。作者提出假设,Phe通过参与蛋白质合成的信号转导通路调节蛋白质的合成。基于此,本试验拟以奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T为研究对象,围绕Phe对MAC-T酪蛋白合成的影响展开试验,关注信号通路关键基因及蛋白对Phe的响应,运用蛋白质组学、同位素标记等,结合分子生物学技术分析酪蛋白合成网络,以期为应用Phe提升牛乳品质奠定理论基础。试验一苯丙氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响为研究Phe对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响,设置五种浓度梯度Phe培养基(以奶牛血清中Phe浓度为参考):-Phe(0 m M Phe,Control)、Phe(0.22m M Phe)、2Phe(0.44 m M Phe)、4Phe(0.88 m M Phe)、8Phe(1.76 m M Phe)及生长培养基作阳性对照(Normal)。检测细胞活力、氨基酸转运载体及酪蛋白合成基因的m RNA和蛋白表达水平。结果表明:Phe处理对细胞活力无显著影响(P>0.05)。与-Phe相比,2Phe、4Phe处理组中氨基酸转运载体ASCT2和LAT1的m RNA表达无显著变化(P>0.05)。4Phe组酪蛋白合成相关基因CSN1S1、CSN2、CSN3的m RNA表达显著升高(P0.05)。e IF2α变化趋势则相反,缺乏Phe促进其磷酸化表达,提高Phe浓度对其活性无影响(P>0.05),表明有充足的可利用氨基酸时,e IF2α通常不会被激活。综合蛋白质组及m TOR通路因子磷酸化结果可知,Phe可通过调控4EBP1和e IF2α的磷酸化水平,提高m TOR信号通路活性,促进奶牛乳腺上皮细胞α-酪蛋白的合成。试验三苯丙氨酸对奶牛乳腺上皮细胞中AAs代谢的影响试验二中蛋白质组学结果显示,Phe代谢通路富集了少数差异蛋白。基于此,本试验利用液相色谱测定了培养基内AAs的代谢情况。结果显示:提高Phe浓度,细胞对Phe的摄取量逐渐增加,且在8Phe处理时达到最高,此时也促进了对Ile的摄取(P稳定同位素标记的Phe(13C9;15N-L-Phenylalanine)培养细胞,鉴定Phe参与的生物代谢途径。结果显示:PAH浓度在Phe、4Phe组中显著降低(P稳定同位素试验中共鉴定到1542种蛋白,其中掺入重标Phe的肽段有940种,共富集于245条通路,除多数未知

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珠芽蓼单宁含量和结构特征以及珠芽蓼单宁-15N标记蛋白质的合成

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作者：王琼兰州大学

学位级别：硕士

陆地生态系统的传统氮循环模式认为,土壤中的无机氮是植物养分的主要来源,然而近年来许多研究结果表明,在氮矿化严重受限的地区如北极苔原和高寒草甸,土壤中的有机氮也可能构成植物养分的重要来源。其中的研究多数集中在植物直接吸收土... 详细信息

陆地生态系统的传统氮循环模式认为,土壤中的无机氮是植物养分的主要来源,然而近年来许多研究结果表明,在氮矿化严重受限的地区如北极苔原和高寒草甸,土壤中的有机氮也可能构成植物养分的重要来源。其中的研究多数集中在植物直接吸收土壤中游离的氨基酸方面,而对于植物菌根真菌分解复杂有机氮化合物如单宁—蛋白质络合物并吸收利用其中氮素的研究非常有限。植物单宁是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物,单宁不仅能够帮助植物抵御病害,降低动物的采食率,它在陆地生态系统养分循环中还起到重要的作用。凋落物中的单宁可与植物体内或土壤中的蛋白质结合,形成稳定的络合物,对绝大多数土壤生物都具有抗性。有研究表明,产生单宁的植物有可能通过其菌根真菌分解这种单宁-蛋白质络合物,获取其中的氮源,从而在与邻近植物的养分竞争中占优势。本研究选取甘肃甘南藏族自治州玛曲县高寒草甸中富含单宁的植物珠芽蓼(Polygonum viviparum L.)作为研究对象,分离提取植物体中的单宁,并通过真菌培养获得稳定同位素N标记的菌丝蛋白质,之后进行单宁—蛋白质络合物的合成。实验过程中测定了玛曲珠芽蓼单宁的含量,单宁的单体类型,单宁络合蛋白质的能力,以及N蛋白质络合物的C:N比,从而为今后研究富含单宁植物吸收土壤中复杂有机氮的研究提供实验材料。主要研究结果如下:(1)玛曲珠芽蓼单宁的种类主要以缩合单宁为主,新鲜叶片各器官中单宁含量顺序为根>种子>花>鲜叶>茎>枯叶,凋落物中的单宁含量可以达到30.82 mg STE/g DW(mg sorghum tannin equivalent/g dry weight)。珠芽蓼单宁络合蛋白质能力较强。缩合单宁的结构单体主要为儿茶素(catechin,C)、没食子儿茶素(gallocatechin,GC)、表儿茶素(epicatechin,EC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG);(2)N标记的真菌蛋白质可通过立枯丝核菌的培养获得,培养条件为25℃,震荡速度120 rpm,培养箱避光培养。培养基为改良Richard培养基,成分为HO,KHPO4·7HO,FeSO·7HO,Agar,MgSO4·7HO,其中碳源为蔗糖,氮源为KNO,以N-KNO为氮源的处理组比以14N-KNO为氮源的对照组生长速率较慢;(3)珠芽蓼单宁可与真菌蛋白质络合形成单宁-蛋白质络合物,络合物C:N为10.52±0.73。本项研究得到以下结论:珠芽蓼富含单宁,且其单宁具有较强的络合蛋白质能力。珠芽蓼单宁—N蛋白质络合物可由前期的真菌培养和后期的化合物络合得到。在今后研究中,将N标记络合物置于珠芽蓼土壤中,将有助于测定珠芽蓼菌根真菌对这种复杂有机氮络合物的分解和吸收利用。本研究结果将为高寒草甸植物吸收有机氮的研究提供重要实验材料,对维护青藏高原生态系统的稳定性和可持续发展具有重要意义。

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稳走同位素标记技术在食品有害物质分析中的应用

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作者：常芮曲阜师范大学

学位级别：硕士

高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是食品有害物质分析的有效工具,但分析结果易受食品基质的影响而偏离真实值。本研究设计、开发了一系列稳定同位素标记探针,用于食品中胺类、α-二羰基化合物和雌激素三类典型有害物质的高灵敏质谱... 详细信息

高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是食品有害物质分析的有效工具,但分析结果易受食品基质的影响而偏离真实值。本研究设计、开发了一系列稳定同位素标记探针,用于食品中胺类、α-二羰基化合物和雌激素三类典型有害物质的高灵敏质谱分析。利用探针的质谱增敏作用提高有害物质检出率,利用稳定同位素标记技术的内标定量功能克服质谱分析中存在的基质效应,提高质谱分析的准确度,为食品质量安全控制提供新思路、新方法,同时为食品加工工艺的改进提供数据支撑。第一章:简述了食品有害物质的色谱、质谱分析方法,讨论了食品有害物质分析中的基质效应问题,介绍了稳定同位素标记质谱分析方法的原理及应用,阐述了本论文的研究思路及研究内容。第二章:设计并合成了两对稳定同位素标记试剂:4-羧基苯基-三甲基铵(d-CPTA)及其氘代产物d-CPTA和3-羧基-1-甲基吡啶(d-CMPD)及其氘代产物d-CMPD;研究了它们的质谱增敏效果,并与商业化衍生试剂丹磺酰氯进行了比较,为稳定同位素标记试剂的设计提供参考。将具有较高质谱灵敏度的CPTA应用于食品及食品包装材料中脂肪胺的稳定同位素标记质谱分析。十种脂肪胺的检出限为4.1-9.0 ng/L,回收率为90.1%-97.1%,基质效应为95.1%-99.8%。第三章:设计并合成了一对全新的同位素标记试剂对三甲胺基苯甲酰肼(d-HCTA)及氘代产物d-HCTA,将其用于α-二羰基化合物的质谱标记分析。比较了HCTA与商业化试剂丹磺酰肼(DNSH)的标记效果,研究了色谱柱填料对α-二羰基化合物色谱行为的影响。将HCTA应用于食品中α-二羰基化合物的定量分析,并对食品中未知的醛类化合物进行拟靶向分析,方法检出限为4.1-9.2ng/L,回收率为90.1%-95.3%,基质效应为96.1%-98.5%。第四章:以三-(4-甲酰苯基)胺(TFPA)和2,4,6-三(4-氨基苯基)-1,3,5-三嗪(At)为原料合成了具有吸附作用的共价有机骨架(COF)TFPA-At,将其用于牛奶样品中雌激素的选择性吸附。以轻型丹磺酰氯(d-DNS-Cl)和重型丹磺酰氯(d-DNS-Cl)为稳定同位素标记试剂,建立了雌激素的稳定同位素标记质谱分析方法。稳定同位素标记方法提高了雌激素分析的准确性和灵敏度,同时有效地克服了基质效应。雌激素的检出限为9-13 ng/L,回收率为89.6%-95.5%,基质效应为96.1-98.9%。

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异位发酵体系中功能微生物驱动氮素迁移的研究

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作者：周思含北京林业大学

学位级别：硕士

异位发酵体系利用微生物的高温好氧发酵高效处理畜禽粪污,减少了环境污染,实现了农业废弃物的资源化利用。在功能微生物的驱动下,粪尿中的有机物逐渐分解,含氮化合物也会完成各个形态的转化。之前的研究发现异位发酵体系具备除氨保氮的... 详细信息

异位发酵体系利用微生物的高温好氧发酵高效处理畜禽粪污,减少了环境污染,实现了农业废弃物的资源化利用。在功能微生物的驱动下,粪尿中的有机物逐渐分解,含氮化合物也会完成各个形态的转化。之前的研究发现异位发酵体系具备除氨保氮的优良性能,为降低氮素损失,提高发酵产物品质,阐明异位发酵体系中功能微生物驱动的氮素转化机制至关重要。本研究测定了异位发酵体系运行过程中的环境特征,利用稳定同位素标记技术和荧光定量PCR技术探究了不同发酵阶段的氮素转化速率和关键功能基因的拷贝数变化,采用宏基因组学技术注释了微生物和与氮素代谢相关的功能基因,并通过揭示微生物与环境特征、功能基因与环境特征、微生物与功能基因之间的相关关系初步建立了异位发酵体系的氮素循环网络,探讨了异位发酵体系的氮素转化机制。异位发酵体系的环境特征为高温、碱性、高氮,含水量基本维持在45%～65%之间。在异位发酵体系中,细菌主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门组成,最丰富的细菌属为芽孢杆菌,温度是驱动细菌群落变异的主要因子。真菌主要由子囊菌门、担子菌门、毛霉门和壶菌门组成,最丰富的真菌属为壶菌属,驱动真菌群落变异的主要因子为氮素含量和温度。Binning重组的109个高质量MAG均隶属于细菌界。在微生物的作用下,异位发酵体系中的新陈代谢作用旺盛。畜禽粪污的持续添加补充了体系的氮素,异位发酵体系中的氮素代谢旺盛,尤其是氮的矿化。由携带ure A/B/C、ans B、asn B基因的芽孢杆菌、细杆菌、盐单胞菌等细菌推动的总氮矿化过程的最高速率可达136.60μg N g d。自养硝化作用是硝态氮产生的主要途径,与高铵态氮含量相关。amo A基因丰度高于其他基因,且与hao、nar G、nir K、nos Z基因丰度一样均在发酵后期降低,有利于减少NO排放。特吕珀菌和异常球菌属不仅参与了反硝化作用,还是hao和gdh＿K00261的潜在宿主。nos Z基因可作为异位发酵体系反硝化作用的表征基因。芽单胞菌属和Gemmatirosa在异位发酵体系的氮素代谢过程中可能同时在厌氧氨氧化、反硝化、矿化这三个过程中发挥重要作用。固氮作用主要由携带nif D/H/K/W基因的肠杆菌属、范菌属和莱略特氏菌等参与完成。本研究阐明了异位发酵体系的环境特征与氮素转化特征,初步揭示了在功能基因编码的相关酶的催化下异位发酵体系中的功能微生物驱动的氮素迁移过程,对降低EFS处理畜禽废弃物过程中的氮素损失、提高发酵产物品质具有重要意义。

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高速逆流色谱大规模纯化和厚朴酚及应用SILAC技术研究和厚朴酚治疗HepG2细胞作用机理

高速逆流色谱大规模纯化和厚朴酚及应用SILAC技术研究和厚朴酚治...

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作者：张强四川大学

学位级别：硕士

背景和目的：和厚朴酚是中药厚朴的主要化学成分。据报道：和厚朴酚具有多途径抗肿瘤机制，如诱导细胞增殖与分化，引起细胞凋亡，其机制与上调促凋亡因子Bid、下调抑凋亡因子Bcl-XL，以及激活p53非依赖、线粒体依赖的Caspase通路有关... 详细信息

背景和目的：和厚朴酚是中药厚朴的主要化学成分。据报道：和厚朴酚具有多途径抗肿瘤机制，如诱导细胞增殖与分化，引起细胞凋亡，其机制与上调促凋亡因子Bid、下调抑凋亡因子Bcl-XL，以及激活p53非依赖、线粒体依赖的Caspase通路有关。由于动物实验需要，我们需要找到一种高效快速的分离技术纯化出大量的和厚朴酚，高速逆流色谱仪是一种液液分离装置，经过多年的改进，发展为一种快速的分离技术，可以和高效液相色谱媲美，是一种分离天然药物的理想的设备。SILAC技术：即是用同位素标记必需氨基酸，将它加到缺乏此氨基酸的培养基，用此培养基培养细胞，经过细胞代谢，标记的氨基酸融合到蛋白中，形成内码子。它与质谱结合，为定量蛋白组提供了和好的技术。本文旨在用高速逆流色谱从植物厚朴中大规模分离和厚朴酚，并利用SILAC技术，将和厚朴酚治疗同位素标记的肝癌细胞HepG2，通过质谱鉴定，用定量蛋白组的方法鉴定出和厚朴酚引起的蛋白调控，从而确定出和厚朴酚抗肿瘤的作用机理。方法：使用英国布鲁内尔提供的分析型HSCCC优化分离的条件，包括流速、进样浓度、进样量。并将优化的条件放大到制备型HSCCC。大规模分离纯化出和厚朴酚。用和厚朴酚治疗经亮氨酸—d3完全标记的肝癌细胞HepG2，提取蛋白，利用质谱检测总蛋白，以保守蛋白β-actine为标准，确定出和厚朴酚引起调控的蛋白。推断出和厚朴酚抗肿瘤作用机理。结果：经分析型HSCC优化，逆流色谱分离的条件为：转速为每分钟1800转;流速为每分钟2.5毫升;进样量为分离柱的5％;进样浓度为每毫升80毫克。这些优化的条件成功的运用到制备型高速逆流色谱。在大规模分离纯化和厚朴酚与厚朴酚中，我们用三种不同的浓度(20mg/ml，75mg/ml，250mg/ml)进样，从59.2克粗品中分离出纯度高达99.9％的厚朴酚24.7克与纯度高达98.6％的和厚朴酚23.2克。我们用10μg/ml浓度和厚朴酚作用HepG2细胞24h。通过质谱鉴定了290个蛋白，其中和厚朴酚引起蛋白上调占了5.5％，下调蛋白占了72.4％;与细胞凋亡相关的蛋白有23个。结论：本文中，我们成功利用了HSCCC大规模纯化和厚朴酚。采用SILAC技术，我们发现了和厚朴酚引起的蛋白调控，其中在与细胞凋亡相关的蛋白中，我们选择Ras GTPase-activating-iike protein IQGAP1(p195)与94kDa glucose-regulated protein(GRP94)进行PCR与Westen-blot验证。证实了和厚朴酚可能通过引起一系列的蛋白调控来诱导细胞的凋亡。

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生命周期中羟基脂肪酸支链脂肪酸酯的分析研究

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作者：严靖雯武汉大学

学位级别：硕士

羟基脂肪酸支链脂肪酸酯(fatty acid esters of hydroxy fatty acids,FAHFAs)是一类重要的内源性脂质分子,具有抗糖尿病和抗炎症等生理功能。自2014年发现至今,关于FAHFA的研究受到了科学界的广泛关注。近年来,科学家们就FAHFAs的生理... 详细信息

羟基脂肪酸支链脂肪酸酯(fatty acid esters of hydroxy fatty acids,FAHFAs)是一类重要的内源性脂质分子,具有抗糖尿病和抗炎症等生理功能。自2014年发现至今,关于FAHFA的研究受到了科学界的广泛关注。近年来,科学家们就FAHFAs的生理功能、代谢路径、在生命体内的储存形式、分析方法开发以及新的FAHFAs种类的发现等方面都进行了不同程度的探索,并取得了一些成果。但目前对于FAHFAs的认识仍然比较初浅,因此探索研究FAHFAs更多未知的生理功能对于进一步深入了解FAHFAs具有重要意义。脂质是生命体的重要组成部分,具有许多重要的生理功能,如构成细胞屏障、细胞膜基质、信号传导和能量存储等,是动物和植物生长发育的必需物质。脂质在生命体内的变化与生命体的生长和衰老过程密切相关。在哺乳动物体内脂质通过调节细胞的生长与凋亡来参与生命体的成长与衰老过程;在植物体内脂质分子亦参与调控植物的萌发、生长、分化、成熟和衰亡等整个生命过程。作为一类新型的脂质分子,FAHFAs与生命体的生长和衰老之间的关系还尚未有研究报道。基于以上的问题,本论文以稳定同位素标记结合液相色谱质谱技术为主要研究手段,以小鼠、水稻和拟南芥为研究对象,从分子层面探讨了FAHFAs与生命周期的关系。具体内容如下:1.基于已开发的FAHFAs全分析技术,非目标性分析了不同年龄小鼠内脏脂肪组织中FAHFAs种类及含量的变化。发现随着年龄的增加,FAHFAs家族和异构体的种类增加。并且幼年,中年和老年三个不同年龄段的小鼠内脏脂肪中FAHFAs的含量有明显的差别。中年时期的小鼠内脏脂肪中FAHFAs的质量浓度低于幼年和老年时期,但是内脏脂肪中FAHFAs总含量却高于另外两个时期。该研究首次表明FAHFAs与小鼠的生长发育和衰老有着密切的联系,为FAHFAs生理功能的探索和研究提供了重要线索。2.基于强阴离子交换固相萃取结合稳定同位素标记辅助液相色谱-质谱联用(SAX-SPE-SIL-UHPLC-MS/MS)分析技术,建立了水稻和拟南芥不同组织中20种FAHFAs异构体的定量方法。利用该方法,成功地在不同生长时期水稻和拟南芥的组织中检测到14种FAHFAs异构体,并探索了这14种FAHFAs异构体含量的时空分布情况。该研究首次获得了FAHFAs在植物中的时空分布信息,为进一步研究植物体内FAHFAs的作用机理提供了数据支撑。3.运用已建立的水稻不同组织中20种FAHFAs异构体的定量方法,探索了镉胁迫环境下生长的水稻中FAHFAs异构体含量的时空分布情况,并且与正常环境下生长的水稻进行对比。结果表明镉胁迫会导致水稻中FAHFAs含量升高。该工作初步探究了镉胁迫对于水稻中FAHFAs含量的影响,为研究植物重金属胁迫与FAHFAs之间的关系提供了新的线索。

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典型海洋微型生物胞内代谢物及自然海水中手性氨基酸的分析

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作者：魏嫣然厦门大学

学位级别：硕士

海洋是一个巨大的有机碳库,对缓解全球气候变化具有重要作用。海洋中95%的溶解有机碳(Dissolved organic carbon,DOC)为生物难以利用的惰性溶解有机碳(Recalcitrant dissolved organic carbon,RDOC),可以在海水中储存数千年。海洋微型... 详细信息

海洋是一个巨大的有机碳库,对缓解全球气候变化具有重要作用。海洋中95%的溶解有机碳(Dissolved organic carbon,DOC)为生物难以利用的惰性溶解有机碳(Recalcitrant dissolved organic carbon,RDOC),可以在海水中储存数千年。海洋微型生物碳泵(Microbial carbon pump,MCP)理论指出海洋微型生物是RDOC碳库的主要贡献者,占海洋总生物量90%以上的细菌、古菌、病毒以及原生动物等微型生物通过转化降解有机质最终产生了难以降解的RDOC,贡献于海洋储碳1。D-氨基酸(D-amino acid,D-AA)是海洋有机碳库的代表分子,难以被微型生物作为碳源或氮源利用2。有研究在天然海水微生物群落的长周期培养过程中发现了 D-AA的产生和积累3。此外,与新鲜DOC相比,D-AA与L-氨基酸(L-amino acid,L-AA)的比值在深海年龄较老的DOC中较高,暗示D-AA是一种难以被微型生物利用的潜在RDOC4。然而,海洋微型生物产生D-AA的种类和浓度尚未见报道,海洋环境中的D-AA的生物来源尚不明确。因此,本研究利用有机磷化学的稳定同位素N-磷酰化氨基酸标记试剂(Stable isotope N-phosphoryl alanine labeling,SIPAL)与氨基酸反应,利用液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术初步对典型海洋环境以及海洋微型生物代谢物中的手性氨基酸进行了定性和定量分析。主要研究内容和结论如下:1.利用SIPAL试剂对海洋微型生物和环境样品的手性氨基酸分析具有可行性。在纯培养的微型生物代谢物中检测到多种D-AA。自然海水中检测到的D-AA种类相对较少,然而,D-甲硫氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸等多种非典型D-AA可以在环境中被检测到,暗示这些非典型D-AA具有一定的惰性特征。2.本研究选取了细菌、古菌和真菌中的12株典型海洋微型生物,开展了海洋微型生物胞内代谢产物中手性氨基酸的定量分析。在12株典型微型生物的胞内代谢产物中都检测到了 D-AA,不同微型生物合成D-AA的量不同,种类也具有差异。不同微型生物的胞内代谢产物中非典型D-AA占总游离手性氨基酸的比例差异不明显。同一属的不同微型生物的胞内代谢物中含有一些游离D-AA,其浓度具有特定的倍数关系。与古菌和真菌相比,细菌胞内代谢物中检测到的游离D-AA最多,表明了细菌可能是海洋环境中D-AA的主要贡献者。

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衍生化-质谱法分析生物样品中的活泼羰基化合物

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作者：滕浩湖南师范大学

学位级别：硕士

内源性活泼羰基类代谢物参与许多重要的生物学过程,如物质代谢和氧化应激,并涉及多类疾病的发生。由于这类化合物含量低、结构多样、稳定性差,生物样品复杂,难以对其进行有效测定。现代质谱技术是代谢物分析的一种利器,但因羰基化合物... 详细信息

内源性活泼羰基类代谢物参与许多重要的生物学过程,如物质代谢和氧化应激,并涉及多类疾病的发生。由于这类化合物含量低、结构多样、稳定性差,生物样品复杂,难以对其进行有效测定。现代质谱技术是代谢物分析的一种利器,但因羰基化合物的离子化效率低,常规的质谱法难以检测。目前,利用衍生化反应引入化学基团以改善待测物的离子化效率及其分析行为,是质谱分析领域的研究热点之一。本文利用稳定同位素标记衍生(Isotope coded derivatization,ICD)结合液相色谱-双中性丢失扫描-质谱技术(ICD-LC-DNLS-MS)建立了一种分析活泼羰基类代谢物的方法,用于复杂生物样本中活泼羰基化合物的筛查和相对定量。主要围绕以下三个方面展开分析研究。1、季铵化功能性衍生试剂的制备与功能比较。设计并合成两种新的季铵化功能性衍生试剂,以四种羰基化合物为底物,评价分析四种衍生剂的性能,寻找衍生产物的裂解方式,比较色谱行为、质谱行为。最终选择1-(4-肼基-4-氧代丁基)吡啶-1-溴化物(HPB)衍生试剂进行下一步的实验。2、基于稳定同位素标记结合液相色谱-双重中性丢失扫描质谱技术(ICD-LC-DNLS-MS)建立了一种分析活泼羰基类代谢物的方法,用于非靶向筛查肉桂提取液中的活泼羰基类代谢物。以一对稳定同位素标记试剂HPB和HPB-d为衍生剂。优化了提取溶剂和衍生化条件,建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法,最终在肉桂提取液中发现了17种潜在的活泼羰基类代谢物。3、运用ICD-LC-DNLS-MS分析策略,优化MRM(multiple reaction monitoring)通用参数,构建活泼羰基化合物的相对定量分析方法,并成功应用于临床尿液样本中活泼羰基类化合物的广谱筛查。通过比较分析糖尿病患者和健康人群人尿中活泼羰基化合物代谢谱,监测出24种活泼羰基类代谢物,并进行了相对定量分析;进一步发现了正常人和糖尿病患者的样本中有显著差异的活泼羰基化合物,它们可能是潜在的疾病标志物。

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不同肥力水平旱地红壤稻秆降解及相关微生物研究

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作者：吴赵越南京师范大学

学位级别：硕士

我国是农业大国,每年稻秆产量巨大。红壤有机质含量低是限制红壤质量的重要因素,稻秆还田提高有机质含量是改善红壤质量的重要措施之一。稻秆结构复杂,还田后在土壤中的降解及转化过程受土壤有机质含量、降解微生物群落等因素影响。微... 详细信息

我国是农业大国,每年稻秆产量巨大。红壤有机质含量低是限制红壤质量的重要因素,稻秆还田提高有机质含量是改善红壤质量的重要措施之一。稻秆结构复杂,还田后在土壤中的降解及转化过程受土壤有机质含量、降解微生物群落等因素影响。微生物全程参与稻秆的分解,且存在微生物群落的接力降解现象。但是,不同肥力水平红壤中稻秆降解及相关功能微生物类群目前还不清楚。本研究选取不同肥力水平的旱地玉米地土壤为研究材料,包括未施肥(CK)土壤、平衡施化肥(NPK)土壤和施加有机肥(OM)土壤。采用宏基因组分析方法明确不同肥力水平土壤间土壤编码碳水化合物降解酶基因的相对丰度,分析不同肥力水平土壤中稻秆的降解潜力;添加稻秆构建土壤悬液培养体系,采用扫描电镜法等方法测定稻秆的降解程度及其降解过程,采用高通量测序分析降解过程中的核心功能微生物类群;添加C-纤维素构建室内微宇宙培养体系,利用稳定同位素核酸探针技术(DNA-SIP)结合高通量测序技术,进一步研究不同肥力水平土壤中降解及活跃的微生物类群。主要研究成果如下:(1)宏基因组学分析发现,CK土壤与OM土壤中编码碳水化合物活性酶基因组成具有多样性且差异显著,CK土壤中编码碳水化合物酯酶,糖苷水解酶,糖基转移酶基因的相对丰度显著高于OM土壤,OM土壤中编码多糖裂解酶和碳水化合物结合模体基因的相对丰度显著高于CK土壤。CK土壤中编码纤维素酶与半纤维素酶基因的相对丰度显著高于OM土壤,而OM土壤中编码木质素酶基因的相对丰度显著高于CK土壤。我们推测不同肥力水平土壤稻秆降解潜力存在一定差异,稻秆在肥力水平低的CK土壤中的降解大于在肥力水平较高的OM土壤中。(2)不同肥力水平土壤稻秆降解实验发现,在OM培养体系中培养8周的稻秆降解程度显著高于CK土壤培养体系,降解率分别为37.8%和26.0%。在稻秆降解过程中,CK和OM土壤培养体系中的稻秆表面附着的细菌群落结构随培养时间发生显著变化,并且OM培养体系中参与稻秆降解的微生物群落的丰富度高于CK培养体系。CK土壤培养体系中前期主要的稻秆降解微生物类群有黄杆菌属、土地杆菌属、伯克氏菌科、梭菌科、瘤胃梭菌属,稻秆降解后期酸杆菌目、梭菌科、瘤胃梭菌属、甲烷杆菌属占主导地位。OM土壤培养体系中前期稻秆降解微生物类群有黄杆菌属、土地杆菌属、伯克氏菌科、纤维弧菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属和梭菌科,稻秆降解后期酸杆菌目、黄杆菌属、土地杆菌属、梭菌科、伯克氏菌科、假单胞菌属、甲烷杆菌属和甲烷八叠球菌属占主导地位。(3)不同肥力水平土壤纤维素降解实验发现,纤维素在肥力水平高的OM土壤中的降解程度高于肥力水平低的NPK土壤以及CK土壤。在CK、NPK、OM培养体系中,纤维素降解生成的CO占添加C-纤维素的比例分别为10.2%,16.3%,26.8%。CK、NPK和OM培养体系中,纤维素的降解速率趋势类似,均表现为在培养前期迅速上升,在后续培养时间降解速率逐步降低。不同处理土壤中占主导地位的纤维素降解微生物不同。CK培养体系中主要的纤维素降解微生物类群有酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门,NPK培养体系中主要的纤维素降解微生物类群有酸杆菌门,放线菌门、变形菌门和厚壁菌门,OM处理中主要的纤维素降解微生物类群有放线菌门、拟杆菌门、变形菌门和芽单胞菌门。CK培养体系中纤维素降解前期由农研丝杆菌属、粘液杆菌属、伯克氏菌属和马赛菌属主导,中后期Occallatibacter和Actinospica占主导地位。NPK培养体系中纤维素降解前期由诺卡氏菌属和链霉菌属主导,中后期Occallatibacter、诺卡氏菌属和产黄杆菌属占主导地位。OM培养体系中纤维素降解前期由链霉菌属、马赛菌属和芽单胞菌属主导,中后期链霉菌属、马赛菌属和柄杆菌属占主导地位。综上所述,基于功能基因预测的结果与稻秆以及纤维素的实际降解不一致,所以基于编码碳水化合物活性酶基因推测不同肥力水平土壤中的稻秆降解能力存在局限性。土壤悬液中稻秆附着微生物与纤维素降解微生物共有微生物在门水平上有:酸杆菌门、拟杆菌门和变形菌门,在属水平有Mucilaginibacter和Cellvibrio。稻秆在不同肥力水平的土壤中降解微生物不同,并且随培养时间降解微生物发生演替,存在接力作用。本研究更全面的了解稻秆在土壤中的降解过程,可为土壤肥力的提高和农作物稻秆的资源化利用提供理论依据。

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