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禾本科植物内生真菌资源及其物种多样性

生态学报 2010年第17期30卷 4771-4781页

作者：王志伟纪燕玲陈永敢亢燕南京农业大学生命科学学院南京210095

植物内生真菌是当代微生物资源研究的一个热门话题,对禾本科植物内生真菌资源研究进行了总结。与冷季型禾本科植物共生的麦角菌科epichlo内生真菌是目前的研究重点,包括偶尔在宿主植物体表形成子座的Epichlo属真菌和几乎完全不形成症状... 详细信息

植物内生真菌是当代微生物资源研究的一个热门话题,对禾本科植物内生真菌资源研究进行了总结。与冷季型禾本科植物共生的麦角菌科epichlo内生真菌是目前的研究重点,包括偶尔在宿主植物体表形成子座的Epichlo属真菌和几乎完全不形成症状的Neotyphodium属真菌。具体介绍该真菌类群的物种多样性及其地理分布多样性,概括了它们在全球各大区域的分布特征。对近年来中国迅速发展的epichlo内生真菌的研究作了总结,最后展望了国际国内epichlo内生真菌资源探索的发展方向。特别指出:冷季型禾本科植物内生真菌在南美洲和亚洲,暖季型禾本科植物内生真菌在热带亚热带地区的研究还相对薄弱,值得今后继续加强探索和挖掘。

关键词：禾本科植物内生真菌资源物种多样性分布

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禾本科植物内生真菌研究13:禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组DNA的快速提取

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南京农业大学学报 2012年第3期35卷 52-56页

作者：王永纪燕玲王晗陈永敢王志伟南京农业大学生命科学学院江苏南京210095

调查我国7省12个不同地区的禾本科植物内生真菌,经分离、培养后鉴定得到2种Epichlo属和4种Neotyphodium属内生真菌。采用改良的QS(improved quick and safe,IQS)法进行禾本科植物内生真菌基因组DNA的提取,并通过PCR进行验证。以生长... 详细信息

调查我国7省12个不同地区的禾本科植物内生真菌,经分离、培养后鉴定得到2种Epichlo属和4种Neotyphodium属内生真菌。采用改良的QS(improved quick and safe,IQS)法进行禾本科植物内生真菌基因组DNA的提取,并通过PCR进行验证。以生长在平板上的菌丝为起始材料,仪器要求简单、操作简便,快速安全、省时省力,整个提取过程大约40 min。该方法和常规SDS法相比,时间缩短到2周,为原来的1/4。以IQS法提取的DNA为模板,检测禾本科植物内生真菌中的NRPS基因,并在NCBI上进行比对分析,发现与已有的NRPS基因高度相似。这种快速提取法所获得的基因组DNA质量高,可用于后续PCR、基因克隆及其他高通量测试,特别适合获取大量真菌菌株基因组DNA时使用。

关键词：禾本科植物内生真菌基因组DNA的提取 NRPS基因 PCR扩增序列比对

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禾本科植物内生真菌总DNA的快速提取和NRPS基因的检测

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禾本科植物内生真菌总DNA的快速提取和NRPS基因的检测

我国Epichloё yangzii内生真菌中NRPS基因的探索和波胺合成基因perA的克隆

2010年中国菌物学会学术年会

作者：王永纪燕玲陈永敢王志伟南京农业大学生命科学学院

禾本科植物内生真菌能与冷季型禾草形成稳定的互利共生关系,一般不会使宿主致病,而且会给宿主带来对干旱、病虫害及动物啃食等的抗性。对各种昆虫和草食动物的抗性主要是由真菌/宿主植物共生体产生的次级代谢产物所导致的。这些次级代... 详细信息

禾本科植物内生真菌能与冷季型禾草形成稳定的互利共生关系,一般不会使宿主致病,而且会给宿主带来对干旱、病虫害及动物啃食等的抗性。对各种昆虫和草食动物的抗性主要是由真菌/宿主植物共生体产生的次级代谢产物所导致的。这些次级代谢产物中,有些重要生物碱是由非核糖体肽合成酶（NRPS,Non-ribosomal peptide synthetase）催化合成的。近年来,关于NRPS催化合成的代谢物的研究日新月异,越来越多的受到人们的关注。目前,真菌总DNA提取主要有SDS法、CTAB法等常规方法。这些方法是挑取新鲜菌丝于液体GY培养基中进行1个月的培养,再进行液氮研磨和不断地抽提,提取步骤繁琐且耗时,难以适以大量的样品的处理。本研究采用了新的真菌总DNA的提取方法（Chi 2009）提取了禾本科植物内生真菌的总DNA,并进行了NRPS基因的检测。相对于SDS法,这种方法快速安全、省时省力,整个提取过程大约40分钟即可完成。提取总DNA时,以生长在平板上的菌丝为起始材料,在将其在提取液中用玻璃棒捣碎真菌细胞壁后直接提取。仪器要求简单、操作简便,所获得的DNA质量可用于后续的PCR、基因克隆以及其它高通量测试的需求。本研究成功地从20个不同内生真菌菌株中提取出了DNA,进行了NRPS2、NRPS5和NRPS8基因的PCR检测,获得了高质量的DNA片段。最后,通过对PCR产物的测序和序列比对分析,确认了PCR产物的准确性。这种快速、简便、安全的真菌总DNA提取法可能还可以用于其它真菌或其它在生物的总DNA的提取,适合高通量的检测技术的实施。

关键词：禾本科植物内生真菌 NRPS 总DNA的提取 PCR扩增序列比对

来源： cnki会议评论

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我国Epichloё yangzii内生真菌中NRPS基因的探索和波胺合成基因p...

作者：王永南京农业大学

学位级别：硕士

Epichloae内生真菌包括有性型的Epichloe属和无性型的Neotyphodium属真菌,能与禾本科植物互利共生。本研究以产子座鹅观草中的内生真菌Epichloe yangzii为实验材料,利用自行设计以及前人的PCR引物研究了我国E. yangzii中NRPS基因分布和... 详细信息

Epichloae内生真菌包括有性型的Epichloe属和无性型的Neotyphodium属真菌,能与禾本科植物互利共生。本研究以产子座鹅观草中的内生真菌Epichloe yangzii为实验材料,利用自行设计以及前人的PCR引物研究了我国E. yangzii中NRPS基因分布和特征;并拓展了一些NRPS基因研究的应用方法。第一,从苏皖浙3省5市13地采集长有子座的鹅观草属植物200多株,经鉴定均为Roegneria kamoji (Ohwi) Keng and Chen.。从中分离菌株80株,各菌株的菌落类型相似,选其中20株研究了形态学特征。菌落正面白色,棉质,质地紧密或疏松,中央隆起,背面棕色至褐色,向周围渐浅,在PDA培养基上生长速度为35.5-67.5mm/21d (25℃);分生孢子无色透明,单个顶生,卵圆形或肾形,长3.6±0.6～5.8±1.2μm,宽2.2±0.1～3.5±0.8μm;分生孢子梗单生,瓶梗状,垂直于菌丝,通常基部或近基部有隔膜,长为14.3±2.3～22.7±2.4μm,基部宽为1.4±0.4～3.2±1.1μm。这些特征与E. yangzii相符。第二,作为提取真菌基因组DNA的方法,本研究对QS (quick and safe)法进行了改良,以玻璃棒手动搅拌和研磨代替电动研磨,同时添加少许玻璃珠,便于棉质菌丝的研磨,将菌丝体于65℃下温浴10 min。以生长在平板上的菌丝体为起始材料,整个提取过程约40分钟,仪器要求简单、操作简便,快速安全、省时省力,并命名为IQS (improved quick and safe)法。用IQS法提取DNA,以此为模板检测了内生真菌中的NRPS基因。这种快速提取法所获得的基因组DNA质量高,可用于后续研究。第三,本研究采用高效的简并引物设计方法,通过CODEHOP在线网站根据一些保守氨基酸序列设计简并引物进行PCR扩增,通过氨基酸序列比对,在禾本科植物内生真菌中发现了多种保守的蛋白,其中编码合成Ferrichrome siderophore的sidC基因是一种NRPS基因,大小为600bp。第四,采用PCR和巢式PCR法进行E. yangzii菌株的NRPS基因检测时发现我国E. yangzii菌株中广泛存在NRPS基因。其中,NRPS2、NRPS5、NRPS6、NRPS7、 NRPS8存在于所有供试菌株中;而其他NRPS基因则在供试菌株中呈现不均匀分布,sidC基因在部分E. yangzii菌株中也有分布。此外,分离自同一地区的4株E. yangzii菌株的NRPS基因分布表现出一定的差异性,同一种NRPS基因在来自不同地点的E. yangzii菌株中也呈现一定差异性。第五,本研究以生物碱波胺合成基因为对象,根据已知片段的保守区域设计引物,用Tail-PCR和普通PCR等技术扩增了3段约3kb的序列,拼接为8.5kb的perA基因。结构域分析显示该片段编码一双模块NRPS。利用3对特异性引物调查我国禾本科植物内生真菌中的perA基因的分布,进一步检测我国菌株合成波胺生物碱的能力。第六,通过对鹅观草、拂子茅、早熟禾和臭草等禾本科植物的检测发现,NRPS8基因片段只存在于含有内生真菌的禾本科植物基因组DNA中,而在不含内生真菌的其他组织材料中并未发现此片段,再次验证NRPS8基因可特异性的检测宏基因组中内生真菌的存在与否。因此,通过宏基因组检测的可证明：内生真菌具有宿主依赖性,只存在于与其共生的宿主体内。本研究调查了不同E. yangzii菌株的形态学特征;改良了真菌基因组DNA的提取方法;利用CODEHOP网站在线设计引物,从我国禾本科植物内生真菌中发现了sidC基因;并调查了不同采样区E. yangzii菌株中NRPS基因的分布;通过对基因的克隆,证明我国的E. yangzii菌株也具有波胺生物碱合成潜力;最后基于某些特殊NRPS基因验证禾本科植物内生真菌的宿主依赖特性,展示了NRPS基因研究的广阔前景。

关键词：禾本科植物内生真菌 E.yangzii NRPS 分布检测 perA

《南京农业大学学报》2013年第36卷总目次

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南京农业大学学报 2013年第6期36卷 I0001-I0010页

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