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粉末链霉菌KR4突变体的构建及产物分析

粉末链霉菌KR4突变体的构建及产物分析

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作者：孔鲁鲁大连理工大学

学位级别：硕士

Fostriecin(福司曲星,FST)及其衍生物是一类很有价值的聚酮化合物,具有广谱的抗肿瘤活性。对FST结构经常进行化学修饰步骤繁琐,而且易引起环境污染,所以探索基因工程途径改造FST的合成过程,可为新型抗生素的研发开辟新的途径。首先,本... 详细信息

Fostriecin(福司曲星,FST)及其衍生物是一类很有价值的聚酮化合物,具有广谱的抗肿瘤活性。对FST结构经常进行化学修饰步骤繁琐,而且易引起环境污染,所以探索基因工程途径改造FST的合成过程,可为新型抗生素的研发开辟新的途径。首先,本实验利用pSETl52载体建立了FST产生菌的转化体系。通过对PEG介导的原生质体转化,接合转移和电转化三种转化方法比较,我们发现接合转移对FST产生菌进行基因工程操作更适合,同时使用含一定浓度的Mg2+,Ca2+和甘氨酸的MS培养基会大大提高FST产生菌与大肠杆菌属间的接合转移效率,并显著加速转化子的生长。对红霉素组合生物合成技术的研究中发现,位于红霉素PKS中的KR6结构域Tyr2699是关键性氨基酸残基,同时我们在对FST的合成酶KR4酶结构域与人、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的谷胱甘肽还原酶氨基酸序列比对时,发现KR4酶域有一个相类似的指纹区域,是与NADPH的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸部分结合部位,FST的侧链上C-11位功能基团-OH是由其聚酮合成酶(polyketidesynthase, PKS)模块4中的酮基还原酶(keoterudcates,KR)酶域决定,所以可以利用基因工程的方法改造KR4酶域的DNA序列,使KR4酶域失活。本文通过同源重组方法在粉末链霉菌中突变了KR4酶域中指纹区域的第一个Gly密码子和与红霉素KR6催化位点Tyr2699相对应的KR4中的Tyr密码子,获得了C-11含酮基的FST突变株,以粉末链霉菌基因组DNA为模板,用PCR技术扩增出KR4及两侧DNA片段。克隆到载体pUC19上,然后利用PCR介导的部分互补引物定点突变方法将KR4中的Tyr(Y)TAC换成Thr(T)密码子ACC, Gly(G)GGC换成Ala(A)GCG。并克隆到pOJ260质粒上,构建了同源重组质粒pOJTA,利用接合转移方法将pOJTA转入粉末链霉菌,并整合于染色体FST合成基因位点。筛选出的整合体FZ在ISP2培养基上生长至少5代后,挑出不能在Apramycin抗性平板上生长但是可在空ISP2培养基上生长的突变菌株FM。PCR和部分基因组DNA序列分析表明突变菌株粉末链霉菌FM染色体上KR4酶域相应位点发生了突变,但摇瓶发酵产物的HPLC分析结果表明：突变株没有检测到11-酮基的FST。分析其原因可能是目标产物量太少,无法检测到信号或者是TE酶对其不能识别脂肪侧链或者是两个氨基酸位点的改变影响了整个聚酮合酶的活性。以上研究结果为研究FST生物合成酶的特征,以及进一步利用组合生物合成技术合成FST类似物奠定了基础。

关键词：聚酮合酶定点突变接合转移同源重组福司曲星链霉菌

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