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中国应用生理学杂志 2020年第3期36卷 279-282页

作者：阮建佳杜岩天津市蓟州区人民医院综合内科天津市蓟州区人民医院药剂科天津301900

目的:探讨神经酰胺通路在青蒿琥酯(Art)抑制肝纤维化过程中的作用。方法:将肝星状细胞(LX-2)分为细胞对照组、Art 350μmol/L组、神经酰胺合酶阻断剂(FB1)6μmol/L组及FB16μmol/L+Art 350μmol/L合用组。每组7个复孔,作用24 h后,收集... 详细信息

目的:探讨神经酰胺通路在青蒿琥酯(Art)抑制肝纤维化过程中的作用。方法:将肝星状细胞(LX-2)分为细胞对照组、Art 350μmol/L组、神经酰胺合酶阻断剂(FB1)6μmol/L组及FB16μmol/L+Art 350μmol/L合用组。每组7个复孔,作用24 h后,收集细胞及上清液进行检测。Western blot法测定神经酰胺合酶2(LASS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)、Caspase-3蛋白的表达,HPLC-FLD法对神经酰胺(Cer)的含量进行测定,MTT法检测LX-2的增殖情况,酶消化法检测羟脯氨酸(Hyp)的含量。结果:与细胞对照组比较,Art处理组神经酰胺合酶的蛋白表达、神经酰胺含量显著增加、LX-2细胞的增殖明显抑制、PPAR-γ和Caspase-3蛋白表达上调、羟脯氨酸分泌抑制(P神经酰胺合酶的蛋白表达和神经酰胺含量显著降低、LX-2细胞增殖显著增加、PPAR-γ和Caspase-3蛋白表达下调、羟脯氨酸分泌增加(P合用可显著降低Art对神经酰胺合酶蛋白的表达和神经酰胺含量升高的作用,减弱Art对LX-2细胞增殖、PPAR-γ、Caspase-3蛋白表达及羟脯氨酸分泌的作用(P神经酰胺合酶-神经酰胺通路增加细胞中神经酰胺水平,发挥抑制肝纤维化的作用。

关键词：肝纤维化神经酰胺神经酰胺合酶青蒿琥酯肝星状细胞

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青蒿琥酯通过神经酰胺合酶—神经酰胺通路抑制肝纤维发生

青蒿琥酯通过神经酰胺合酶—神经酰胺通路抑制肝纤维发生

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作者：杜岩天津医科大学

学位级别：硕士

肝纤维化表现为肝脏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)异常大量沉积,其生成大于降解,尤其是I型胶原大量沉积,若不采取治疗措施可发展为肝硬化甚至肝癌。在肝纤维化形成的进程中,其中心环节为HSCs的增殖和激活,活化的HSCs增殖显著、... 详细信息

肝纤维化表现为肝脏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)异常大量沉积,其生成大于降解,尤其是I型胶原大量沉积,若不采取治疗措施可发展为肝硬化甚至肝癌。在肝纤维化形成的进程中,其中心环节为HSCs的增殖和激活,活化的HSCs增殖显著、胶原分泌增多,细胞外基质的沉积与其降解失去平衡,肝脏功能受到破坏。近年来随着对肝纤维化发病原因及机制研究的深入,提出肝纤维化是可逆转的。治疗肝纤维化的药物有很多种,本文选用青蒿琥酯作为工具药。目的探讨青蒿琥酯影响肝星状细胞产生神经酰胺的作用,初步揭示神经酰胺合酶-神经酰胺通路在青蒿琥酯抑制肝纤维发生中的作用。方法1、选用体外培养的人源肝星状细胞LX-2为实验对象,实验分为细胞对照组、青蒿琥酯组、油酰乙醇胺组及两药合用组,采用MTT法测定LX-2的增殖,比色法检测各组LX-2上清中乳酸脱氢酶活性,应用HPLC-FLD法对LX-2上清中神经酰胺(C2)的含量进行测定,Western Blot法检测各组中PPAR-γ、p53、Caspase-3蛋白的表达,酶消化法测定羟脯氨酸的含量。2、LX-2为实验对象,实验分为细胞对照组、Fumonisn B1组、青蒿琥酯组及青蒿琥酯与Fumonisn B1合用组,MTT法检测各给药组对LX-2增殖的影响,Western Blot法测定神经酰胺合酶(LASS2)的表达,HPLC-FLD法测定各给药组LX-2上清中神经酰胺(C2)的含量变化,Western Blot法检测与LX-2增殖及凋亡相关的PPAR-γ、p53、Caspase-3蛋白的表达,酶消化法测定羟脯氨的含量。结果1、与细胞对照组比较,青蒿琥酯各剂量均可显著抑制LX-2的增殖,差异具有统计学意义(P0.05);青蒿琥酯可显著增加LX-2上清中神经酰胺的含量,且具有剂量依赖性,差异具有统计学意义(P0.05);与细胞对照组比较,LX-2上清中神经酰胺水平显著上升(P合用药物作用均加强。2、与细胞对照组比较,Fumonisn B1 6μmol/L处理LX-2时细胞增殖显著,Fumonisn B1 6μmol/L与青蒿琥酯250μmol/L、350μmol/L、450μmol/L合用后,均可显著降低青蒿琥酯对LX-2的增殖抑制作用;与细胞对照组比较,应用Fumonisn B1后LASS2的表达下降,青蒿琥酯可显著提高LASS2的表达,Fumonisn B1能减低青蒿琥酯提高LASS2表达的作用;Fumonisn B1具有降低青蒿琥酯增加神经酰胺含量的作用;与二者合用组比较,PPAR-γ、p53、Caspase-3蛋白表达及羟脯氨酸水平在青蒿琥酯单用组最高,Fumonisn B1单用组最低,差异皆有统计学意义(P神经酰胺水平,均能增加PPAR-γ、p53、Caspase-3表达,青蒿琥酯呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制LX-2增殖,促进LX-2凋亡,减低羟脯氨酸的产生。2、青蒿琥酯通过上调神经酰胺合酶-神经酰胺通路,提高神经酰胺的水平,进而增加PPAR-γ、p53、Caspase-3蛋白表达,发挥抑制肝纤维发生的作用。

关键词：青蒿琥酯肝星状细胞神经酰胺神经酰胺合酶

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伏马毒素B1通过抑制CerS2表达诱导内质网应激破坏猪肠上皮屏障

伏马毒素B1通过抑制CerS2表达诱导内质网应激破坏猪肠上皮屏障

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作者：李孟聪南京农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素B（Fumonisin B,FB）是由镰刀菌属产生的一类有毒次生代谢产物。该化合物理化性质稳定,碾磨、加热等处理也无法破坏其结构,导致FB能够在食品或饲料中长期存在,对食品安全管理工作和畜禽健康养殖造成了严重威胁。胃肠道是抵御食... 详细信息

伏马毒素B（Fumonisin B,FB）是由镰刀菌属产生的一类有毒次生代谢产物。该化合物理化性质稳定,碾磨、加热等处理也无法破坏其结构,导致FB能够在食品或饲料中长期存在,对食品安全管理工作和畜禽健康养殖造成了严重威胁。胃肠道是抵御食物污染物的第一道屏障。但是,目前对FB肠毒性的了解有限。猪是对FB高度敏感的农场动物,因此,本研究选择猪肠上皮细胞（IPEC-J2）为研究对象,探讨FB对肠上皮的影响,并剖析了FB诱导肠上皮损伤的机制。研究分为以下两部分:1、FB诱导肠上皮屏障功能损伤本研究首先观察了FB暴露48 h后对肠上皮细胞的影响。结果表明80μM及更高浓度的FB明显抑制了肠上皮细胞活力（P≤0.05或P≤0.01）。此外,80μM的FB还显著促进了胞质中乳酸脱氢酶（LDH）的释放（P≤0.05）,并且随着FB浓度的增加、培养液上清中LDH的含量也随之提高。肠上皮细胞间的紧密连接（TJs）是肠道物理屏障的主要组成成分。实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）检测发现FB的暴露会明显抑制TJs中zo-1（58.65%）,occludin（45.48%）,claudin-1（50.74%）的转录水平。免疫印迹实验（WB）进一步在蛋白水平上证明FB可抑制TJs的表达（P≤0.05或P≤0.01）。上皮细胞调节、分泌的细胞因子构成了肠道抵御外界污染物重要的免疫屏障。因此,研究又检测了细胞中促炎因子表达量的变化。结果表明80μM的FB显著促进转化生长因子-β、白介素-1β、白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子（tnf-α）等的m RNA表达（P≤0.05,P≤0.01或P≤0.001）。值得指出的是,即使是在FB相对较低的暴露浓度下（40μM）,tnf-α的转录水平也被显著上调（P≤0.01）。因此,研究随后对TNF-α的蛋白水平也进行了检测,WB结果与q RT-PCR结果一致。同时,调节TNF-α表达和活性的信号分子如TNF-α转换酶（TACE）、TNF-α受体（TNFR1）的表达水平也在80μM FB的作用下显著升高（P≤0.05或P≤0.01）。2、FB诱导肠上皮屏障功能损伤的机制研究本研究在前期观察中发现FB的暴露会诱导肠上皮物理和免疫屏障功能的损伤。鉴于此,本研究又进一步探讨了FB诱导肠上皮屏障功能障碍的机制。结果表明80μM的FB显著抑制cers家族的转录表达,尤其是cers2（P≤0.01）。WB结果也验证了FB在蛋白水平上对CerS2的抑制（P≤0.01）。由于CerS是内质网合成的蛋白且其在内质网膜上调节脂质代谢,FB对CerS2的抑制可能会阻断内质网中蛋白质的合成及脂质代谢,破坏内质网的稳态,诱导内质网应激。因此,本研究又在m RNA及蛋白水平上检测了内质网应激的标志物-未折叠蛋白反应（UPR）信号轴的表达情况。结果表明,80μM的FB显著上调了葡萄糖调节蛋白78（grp78）的转录表达（P≤0.01）。与grp78结合的三个UPR传感器,肌醇需要酶1（IRE1）、蛋白激酶RNA激活样内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）的m RNA和蛋白水平也均有明显升高（P≤0.05或P≤0.01）。此外,受UPR传感器调控的下游基因的表达水平也均显著上调,如受ire1激活的X盒结合蛋白1（xbp1）的m RNA表达量增加并促进自我剪切形成s-xbp1;perk调控的真核细胞翻译起始因子（eif2α）、转录激活因子4（atf4）也呈高水平表达。总之,结果提示FB可能通过抑制CerS2的表达、诱导细胞发生内质网应激。为了验证以上猜想,研究首先用siRNA抑制CerS2的表达,观察肠上皮细胞中内质网应激标志物的表达水平。结果表明,si-CerS2的处理会显著上调grp78、perk、eif2α、atf4、atf6、ire1、xbp1及其剪切体（s-xbp1）的m RNA水平（P≤0.05或P≤0.01）。蛋白水平的检测也肯定了si-CerS2对PERK、ATF6、IRE1表达的诱导作用。随后,我们用80μM的FB处理过表达CerS2的IPEC-J2细胞,以进一步观察CerS2表达和内质网应激在FB毒理学中的联系。结果表明,CerS2过表达可以有效抑制FB对grp78、perk、atf6、ire1等内质网应激标志物m RNA水平的上调。WB结果与m RNA水平变化一致,证明了FB通过抑制CerS2的表达、诱发内质网应激。接下来本研究又探讨了CerS2抑制和内质网应激与FB诱导的肠屏障损伤的关系。在过表达CerS2的IPEC-J2中,检测FB处理后TJ以及炎性因子的表达情况。结果表明CerS2过表达有效抑制了FB引起的TJs表达的下调以及对TNF-α表达的上调。4-苯基丁酸（4-

关键词：伏马毒素B1 肠上皮细胞屏障功能内质网应激神经酰胺合酶

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人源CerS2重组腺病毒构建及其对肝癌细胞HepG2细胞周期的作用

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重庆医学 2018年第31期47卷 3978-3981,3986页

作者：杨小理钱玥欧阳旭红向加林杨艳王凤学遵义医学院附属医院医学检验科贵州遵义563003 遵义医学院检验医学院贵州遵义563003 贵州省遵义市第一人民医院检验科 563003

目的探讨神经酰胺合酶2(CerS2)过表达对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响及可能机制。方法化学合成人源CerS2基因CDS区并构建重组穿梭质粒pDC315-CerS2-绿色荧光蛋白(GFP),采用Admax系统将成功构建的CerS2重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK29... 详细信息

目的探讨神经酰胺合酶2(CerS2)过表达对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响及可能机制。方法化学合成人源CerS2基因CDS区并构建重组穿梭质粒pDC315-CerS2-绿色荧光蛋白(GFP),采用Admax系统将成功构建的CerS2重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP实现重组,并进行扩增、纯化及滴度测定。将正确构建的Adv-CerS2-GFP重组腺病毒与空载分别感染肝癌细胞HepG2(即对照组、空载组、实验组),激光共聚焦显微镜定位CerS2-GFP融合蛋白的表达,流式细胞术PI法检测各组细胞周期的分布;RT-qPCR、Western blot法检测各组细胞CerS2、p27mRNA及蛋白表达水平。结果经测序分析验证重组腺病毒构建成功。HepG2实验组CerS2、p27mRNA、蛋白相对表达水平较对照组、空载组明显增加(P0.05),实验组细胞较对照组、空载组G_0/G_1期百分比明显增加(P<0.01);G_2/M、S期明显减少(P<0.01)。结论成功构建人源CerS2重组腺病毒且过表达的CerS2导致肝癌细胞HepG2细胞周期G_0/G_1期阻滞,其机制可能是通过上调p27从而抑制肝癌细胞的生长与增殖。

关键词：神经酰胺合酶重组腺病毒细胞周期 p27 激光扫描共聚焦显微镜

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